環(huán)黃芪醇對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡和TERT表達的影響.pdf

1、缺血性腦血管疾病是嚴(yán)重威脅人類健康的常見疾病之一，在缺血性腦血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中，會發(fā)生腦缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)，其嚴(yán)重影響疾病的治療和預(yù)后，因此加強對腦缺血再灌注損傷的病理生理機制及防治措施的研究成為一項重要的醫(yī)學(xué)課題。黃芪是一種被廣泛應(yīng)用于治療缺血性腦血管病的傳統(tǒng)中藥，在 IRI方面的防治作用日益被重視。環(huán)黃芪醇(cycloastragenol,CAG)是黃芪有效部位黃芪甲

2、苷的苷元，在體外實驗中被證實有顯著的端粒酶激活作用，而端粒酶是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護措施，在腦缺血再灌注損傷中，過表達的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase,TERT）能起到腦保護作用。環(huán)黃芪醇對腦缺血再灌注損傷有無保護作用及其機制尚不明確。本研究通過建立腦缺血再灌注損傷大鼠模型，術(shù)前給予環(huán)黃芪醇干預(yù)，通過檢測大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死灶容積百分比，觀察環(huán)黃芪醇對大鼠腦缺血再灌注損傷的減輕作用；通過

3、免疫組化和蛋白印跡法測定大鼠腦組織中TERT表達的變化和TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡的情況，探討環(huán)黃芪醇抑制神經(jīng)元凋亡、提高TERT的表達，從而減輕腦缺血再灌注損傷的分子機制，為環(huán)黃芪醇防治腦缺血再灌注損傷提供依據(jù)。
　　第一部分環(huán)黃芪醇對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的減輕作用
　　目的：
　　探討環(huán)黃芪醇對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的減輕作用。
　　方法：
　　1實驗對象的分組與處理
　　選取60只雄性

4、SD大鼠隨機分為假手術(shù)組，模型組，環(huán)黃芪醇低劑量組（2.5 mg/kg/d）、中劑量組（5.0 mg/kg/d）、高劑量組（10 mg/kg/d）和血塞通對照組（20 mg/kg/d），每組10只。每天灌胃給藥1次，連續(xù)7天，第7天給藥1h后進行造模，假手術(shù)組和模型組給予等體積的0.5％CMC-Na混懸劑。
　　2.局灶性腦缺血再灌注模型的制備
　　采用Zea Longa線栓法略做改良制作大鼠右側(cè)大腦中動脈栓塞（MCAO）模

5、型，缺血2h后拔出線栓，再灌注24h后，進行各項指標(biāo)的檢測。
　　3.大鼠Garcia JH神經(jīng)功能評分
　　再灌注損傷24h后，采用雙盲法，按照Garcia JH大鼠神經(jīng)功能評分標(biāo)準(zhǔn)，進行神經(jīng)功能評分。
　　4.大鼠腦梗死灶容積百分比
　　再灌注損傷24h后處死大鼠，斷頭取腦，經(jīng)TTC染色，拍照，計算腦梗死灶容積百分比。
　　結(jié)果：
　　1.環(huán)黃芪醇對大鼠Garcia JH神經(jīng)功能評分的影響

6、　　與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低（P<0.01）；與模型組相比，環(huán)黃芪醇中、高劑量組的神經(jīng)功能評分均升高（P<0.05）；環(huán)黃芪醇低劑量組與模型組統(tǒng)計無差異（P>0.05）。
　　2.環(huán)黃芪醇對大鼠腦梗死灶容積百分比的影響
　　與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦梗死灶容積百分比顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，環(huán)黃芪醇中、高劑量組、血塞通組腦梗死灶容積百分比降低（P<0.05）；環(huán)黃芪醇低劑量組與模型組統(tǒng)計

7、無顯著性差異（P>0.05）。
　　小結(jié)：
　　環(huán)黃芪醇能提高腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能評分，減小腦梗死灶容積百分比。環(huán)黃芪醇可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。
　　第二部分環(huán)黃芪醇對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡和TERT表達的影響
　　目的：
　　觀察環(huán)黃芪醇對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）表達的影響，探討環(huán)黃芪醇減輕腦缺血再灌注損傷的作用機制。
　　方法：
　　檢測TERT蛋

8、白的表達：將雄性SD大鼠隨機分成3組：假手術(shù)組、模型組、環(huán)黃芪醇組(10mg/kg/d)，除假手術(shù)組外，其余各組均進行 MACO造模，給藥和造模方式同第一部分。在腦缺血再灌注24h后，以缺血側(cè)腦皮質(zhì)，半暗區(qū)為主要取材和觀察部位，通過免疫組織化學(xué)法和蛋白印跡法檢測大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)中TERT蛋白的表達。
　　檢測神經(jīng)元凋亡：將雄性SD大鼠隨機分成5組：假手術(shù)組、模型組、環(huán)黃芪醇組(10mg/kg/d)、端粒酶抑制劑疊氮胸苷(ATZ)組(

9、20mg/kg/d)、環(huán)黃芪醇(10mg/kg/d)+端粒酶抑制劑(ATZ)組(20mg/kg/d)。給藥和造模方式同上，腦缺血再灌注24h后，通過TUNEL染色法檢測大鼠缺血側(cè)半暗帶區(qū)神經(jīng)元的凋亡指數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化法測定TERT蛋白的表達：與假手術(shù)組相比，模型組TERT的表達升高（P<0.05）。與模型組相比，環(huán)黃芪醇組TERT表達升高（P<0.05）。
　　2.Western blot法測定顯示：

10、與假手術(shù)組相比，模型組TERT蛋白的表達增加（P<0.05）；與模型組相比，環(huán)黃芪醇組TERT蛋白表達增加（P<0.05）。
　　3.TUNEL法檢測神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況：與假手術(shù)組相比，模型組、端粒酶抑制劑組、端粒酶抑制劑+環(huán)黃芪醇組的凋亡指數(shù)（AI）均上升(P<0.01)；與模型組比較，環(huán)黃芪醇組凋亡指數(shù)（AI）明顯降低(P<0.05)；與環(huán)黃芪醇組相比，端粒酶抑制劑+環(huán)黃芪醇組凋亡指數(shù)（AI）上升(P<0.05)；與抑制劑組比

11、較，抑制劑+環(huán)黃芪醇組凋亡指數(shù)(AI)無顯著差異（P>0.05）。
　　小結(jié)：
　　1.環(huán)黃芪醇能提高腦缺血再灌注大鼠腦組織TERT的表達，推測此為環(huán)黃芪醇減輕腦缺血再灌注損傷作用的機制之一。
　　2.環(huán)黃芪醇能抑制腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡，該作用是通過促進TERT表達來實現(xiàn)的。
　　結(jié)論：
　　1.環(huán)黃芪醇能提高腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能評分，減小腦梗死灶容積百分比，減輕缺血再灌注腦組織的損傷。