淫羊蒮苷對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制探討.pdf

1、應(yīng)激性是生物體的普遍特性。應(yīng)激(Stress)是指機(jī)體受到各種應(yīng)激原刺激時出現(xiàn)的以交感神經(jīng)興奮性增高和下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPAaxis)過度激活為主的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)。HPA軸持續(xù)反復(fù)激活導(dǎo)致其終末靶腺腎上腺皮質(zhì)分泌過多的GC,是應(yīng)激反應(yīng)的最重要特征。海馬對應(yīng)激反應(yīng)有整合作用,對GC的分泌起非常重要的調(diào)節(jié)作用,是HPA軸應(yīng)激反應(yīng)的高位調(diào)節(jié)中樞,是慢性應(yīng)激損傷的敏感區(qū)

2、。生理劑量的GC對機(jī)體有益,而過量的GC則對機(jī)體有害,特別是對海馬神經(jīng)元產(chǎn)生不良作用。細(xì)胞凋亡是GC導(dǎo)致海馬神經(jīng)元損傷的其中最主要機(jī)制之一。已有研究表明,淫羊藿具有改善學(xué)習(xí)記憶功能及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。但淫羊藿苷對皮質(zhì)酮所致海馬神經(jīng)元損傷保護(hù)作用的具體機(jī)制尚未見報道。
　　 研究目的:探討淫羊藿苷對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的大鼠原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元損傷保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1.采用新生24h以內(nèi)Spr

3、ague-Dawley大鼠原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元。
　　 2.采用MTT法和LDH釋放法觀察皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的存活率以及淫羊藿苷干預(yù)后的影響。
　　 3.采用Hochest33258、TUNEL原位熒光染色、線粒體跨膜電位以及caspase-3分光光度法檢測淫羊藿苷干預(yù)后對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元凋亡的影響。
　　 4.采用熒光分光光度法利用Fura2-AM熒光探針檢測淫羊藿苷干預(yù)后海馬神經(jīng)元胞內(nèi)游離鈣離子濃

4、度的變化。
　　 5.采用DCFH-DA熒光探針檢測淫羊藿苷干預(yù)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元活性氧的水平并檢測細(xì)胞內(nèi)總SOD的含量。
　　 6.采用Westernblot蛋白檢測方法探索淫羊藿苷神經(jīng)保護(hù)作用的可能作用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路MAPK和P13K/Akt。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.1形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示,1uM和10uM濃度的CORT對海馬神經(jīng)元的作用較明顯,其突觸、包膜和胞核均有不同程度的損傷,表現(xiàn)為突起斷裂,

5、包膜不完整,胞體膨脹,胞核固縮,而10nM、50nM、100nM幾乎對神經(jīng)元無作用。淫羊藿苷能夠逆轉(zhuǎn)這種損傷作用。
　　 2.2MTT法和LDH法結(jié)果顯示,1uM和10uM濃度的CORT作用于原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元24h后,其細(xì)胞存活率分別為58.1％和44.7％,作用于48h后分別下降為46.3％和16.8％,至72h后,其細(xì)胞存活率均接近15％,且呈濃度和時間依賴性下降,用10-5-10-6mmol/L三個濃度的淫羊藿苷預(yù)處理2

6、h,然后和1uM的皮質(zhì)酮共孵育24h,發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能明顯減少皮質(zhì)酮干預(yù)后的神經(jīng)元的損傷,與對照組相比有顯著性差異(p＜0.01),但三個劑量之間無明顯差異。SB203580是MAPK通路中p38MAPK特異性阻斷劑,LY294002是P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中P13K的抑制劑,采用這兩個阻斷劑分別特異性阻斷這兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,則淫羊藿苷的保護(hù)作用被抵消。
　　 3.3HochesG3258,TUNEL原位熒光染色、線粒體跨膜

7、電位以及capase-3檢測結(jié)果顯示,大鼠海馬神經(jīng)元暴露于1uM皮質(zhì)酮24h后出現(xiàn)明顯的核濃縮和胞體膨脹,而正常對照組則表現(xiàn)為圓形的細(xì)胞核形態(tài)。給與10-6mmol/L淫羊藿苷干預(yù)后,與模型組比較,核固縮的神經(jīng)元比例大幅降低。皮質(zhì)酮干預(yù)海馬神經(jīng)元24h后,經(jīng)TUNEL法檢測可見較多的凋亡陽性細(xì)胞,數(shù)個成群分布,表現(xiàn)為細(xì)胞核紅色著染、核染色質(zhì)濃縮與邊移等凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征。而正常組只有較少的紅染得凋亡陽性細(xì)胞。用淫羊藿苷干預(yù)后,細(xì)胞核紅染

8、的凋亡陽性細(xì)胞比例減少,提示淫羊藿苷能夠抑制皮質(zhì)酮所致的海馬神經(jīng)元凋亡。用Rhodamine123熒光探針檢測神經(jīng)元內(nèi)線粒體跨膜電位,染色結(jié)果顯示,正常對照組幾乎見不到綠色熒光,而皮質(zhì)酮干預(yù)組綠色熒光非常強(qiáng),淫羊藿干預(yù)后,綠色熒光減弱。Caspase-3檢測結(jié)果顯示,模型組較空白對照組caspase-3的OD值明顯升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);淫羊藿處理后其OD值和相對活性有極顯著的降低(P＜0.01)。
　　 4.本研究

9、發(fā)現(xiàn)1uM皮質(zhì)酮作用于海馬神經(jīng)元24h后,其胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度較空白對照組明顯升高,統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異(P＜0.01),用10-6mmol/L淫羊藿苷干預(yù)后能顯著抑制有皮質(zhì)酮引起的海馬神經(jīng)元胞內(nèi)游離鈣離子濃度的異常升高,統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 5.在本研究中我們采用DCFH-DA熒光探針進(jìn)行活性氧的檢測,同時檢測神經(jīng)元總SOD,結(jié)果顯示,皮質(zhì)酮干預(yù)海馬神經(jīng)元后,表現(xiàn)為綠色熒光增強(qiáng),提示神經(jīng)元活性氧水平升高,但

10、淫羊藿苷干預(yù)后無變化。同時,總SOD結(jié)果也顯示,淫羊藿對皮質(zhì)酮所致的海馬神經(jīng)元總SOD下降無逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。表明淫羊藿苷的保護(hù)作用可能與氧化應(yīng)激無關(guān)。
　　 6.我們采用Western blot方法檢測ICA對皮質(zhì)酮所致海馬神經(jīng)元損傷保護(hù)作用。在參照文獻(xiàn)基礎(chǔ)上,我們選擇了四個時間點30min,1h,2h,3h。結(jié)果顯示皮質(zhì)酮作用于30min內(nèi)顯著誘導(dǎo)了MAPK三個關(guān)鍵信號分子p38MAPK,ERK1/2和JNK的激活,且3h內(nèi)持續(xù)激活

11、,用ICA預(yù)處理2h,抑制了p38MAPK的激活,且隨著作用時間的延長,其抑制作用越強(qiáng)。但是ICA對ERK1/2和JNK的激活無影響。結(jié)果顯示,ICA對皮質(zhì)酮所致的海馬神經(jīng)元損傷有顯著的保護(hù)作用,并且在損傷的最初就顯示了良好的保護(hù)作用。
　　 7.我們采用western blot方法檢測ICA對皮質(zhì)酮所致海馬神經(jīng)元損傷保護(hù)作用。在參照文獻(xiàn)基礎(chǔ)上,我們選擇了四個時間點30min,1h,2h,3h。結(jié)果顯示皮質(zhì)酮作用于30min內(nèi)顯

12、著抑制了P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵分子Akt的磷酸化,且3h內(nèi)持續(xù)抑制,用ICA預(yù)處理2h,激活了AKT的磷酸化,且各個時間點無明顯差別。結(jié)果顯示,ICA對皮質(zhì)酮所致的海馬神經(jīng)元損傷有顯著的保護(hù)作用,并且在損傷的最初就顯示了良好的保護(hù)作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.淫羊藿苷對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用,其可能與抑制神經(jīng)元凋亡、降低神經(jīng)元胞內(nèi)鈣超載有關(guān),但與神經(jīng)元的氧化應(yīng)激無關(guān)。