α-硫辛酸對電點燃致癇大鼠海馬的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:癲癇是一種慢性的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以周期性復(fù)發(fā)和自發(fā)性發(fā)作為特點。在成人，顳葉癲癇是最常見也是最棘手的。除了癲癇發(fā)作的影響，病人還會因海馬的進(jìn)一步損害而發(fā)生認(rèn)知功能的障礙。實驗動物模型研究表明，短暫重復(fù)發(fā)生的癲癇會導(dǎo)致海馬損傷進(jìn)而導(dǎo)致一定程度的認(rèn)知功能損害。癲癇確切機(jī)制還不十分清楚，可能的機(jī)制有:興奮性氨基酸毒性學(xué)說、能量代謝失衡、鈣超載、氧化應(yīng)激、致炎因子損傷、細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡信號通路是癲癇后神經(jīng)元損傷的重要機(jī)制。Bax

2、是參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞因子。Bcl-2是抗凋亡蛋白，其生理功能是延長細(xì)胞壽命，防止細(xì)胞老化，阻遏細(xì)胞凋亡。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brainderivedneurophicfactor，BDNF)是1982年由德國神經(jīng)化學(xué)家Barde等人首次從豬腦中分離純化出一種蛋白質(zhì)，具有促進(jìn)神經(jīng)生長活性的重要作用。BDNF作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的某些特定神經(jīng)元，有助于支持現(xiàn)有神經(jīng)元的存活和促進(jìn)新的神經(jīng)元和突觸的生長和分化。研究證實，癲癇

3、發(fā)作能夠形成神經(jīng)細(xì)胞損傷及丟失，因此探尋新的神經(jīng)保護(hù)劑具有重要的現(xiàn)實意義。
　　硫辛酸是B類維生素物質(zhì)，許多食物中存在比較豐富的硫辛酸，在人體中，硫辛酸存在于身體的各個部分，硫辛酸具有極強(qiáng)的抗氧化能力并且容易透過血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，正因為如此其藥理價值受到許多專家和學(xué)者的廣泛關(guān)注。硫辛酸能夠?qū)寡趸瘧?yīng)激引起的細(xì)胞凋亡。還可抑制神經(jīng)細(xì)胞老化過程中的細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率。
　　本實驗采用成年雄性Wistar大鼠，通過杏

4、仁基底外側(cè)核電點燃法建立大鼠慢性癲癇模型，根據(jù)Racine分級評價癲癇發(fā)作的級別并記錄癲癇大鼠持續(xù)后放電時間;并給予α-硫辛酸干預(yù)，觀察干預(yù)前后大鼠癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度及持續(xù)時間，觀察各組大鼠的行為學(xué)，海馬組織形態(tài)學(xué)，并運(yùn)用WesternBlot及免疫組織化學(xué)方法在大鼠海馬組織細(xì)胞中觀察指標(biāo)BDNF、Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)，以研究大鼠杏仁核電點燃癲癇模型中，α-硫辛酸的腦保護(hù)及抗癲癇作用，并進(jìn)行探究其可能存在的機(jī)制。
　　方法

5、:將36只7-8周體重250-300g清潔級Wistar成年雄性大鼠隨機(jī)分為:假手術(shù)組、正常對照組、癲癇組、正常硫辛酸組、電刺激硫辛酸低劑量組、電刺激硫辛酸高劑量組，每組各6只大鼠。正常對照組:0.9％的生理鹽水40mg/kg大鼠每日腹腔注射，于早上08:30-09:30之間進(jìn)行藥物注射，共15次。假手術(shù)組:電極植入杏仁核后，不給予電刺激。癲癇組:植入電極后每天按120％發(fā)作閾值電刺激一次，電刺激15天。正常硫辛酸組:不做任何處置的大鼠

6、α-硫辛酸按40mg/kg腹腔注射，共15次。電刺激硫辛酸低劑量組:杏仁核植入電極后，α-硫辛酸按20mg/kg腹腔注射30min后按120％發(fā)作閾值刺激一次/日，共15次。電刺激硫辛酸高劑量組:杏仁核植入電極后，α-硫辛酸按40mg/kg腹腔注射30min后按120％發(fā)作閾值刺激一次/日，共15次。電刺激后觀察。依據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)觀察每組動物行為學(xué)表現(xiàn)。實驗結(jié)束后24小時，灌注取腦，每組取6只大鼠，用HE染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元損

7、傷的影響，用免疫組織化學(xué)方法檢測在海馬CA1區(qū)Bcl-2、Bax及BDNF的蛋白表達(dá)情況。同時每組另取6只大鼠，斷頭取腦，生理鹽水中快速分離海馬，用WesternBlot方法檢測海馬Bcl-2、Bax及BDNF蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、行為學(xué)觀察癲癇組大鼠經(jīng)重復(fù)給予電刺激，發(fā)作等級逐漸升高，最終達(dá)到3次以上Ⅳ-Ⅴ級發(fā)作。電刺激硫辛酸低劑量組、電刺激硫辛酸高劑量組大鼠發(fā)作強(qiáng)度較癲癇組減輕，多集中在Ⅱ-Ⅲ級。正常對照組

8、、正常硫辛酸組及假手術(shù)組大鼠無癲癇發(fā)作。
　　2、HE染色結(jié)果正常對照組、假手術(shù)組及正常硫辛酸組:海馬區(qū)神經(jīng)元排列整齊，層次較多，形態(tài)正常，核仁清晰，胞漿透亮，染色質(zhì)均勻分布，未見明顯的神經(jīng)元丟失。癲癇組:海馬神經(jīng)元的分布紊亂，邊界不清晰，間隙增大，神經(jīng)元丟失明顯，呈嗜酸性細(xì)胞，包括細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)濃縮，核固縮;電刺激硫辛酸低劑量組、電刺激硫辛酸高劑量組:海馬細(xì)胞形態(tài)趨于正常，排列整齊，細(xì)胞的剩余數(shù)量與癲癇組相比增加，只有一小數(shù)量

9、的嗜酸性粒細(xì)胞。
　　3、Westernblot檢測結(jié)果大鼠海馬BDNF表達(dá)水平癲癇組較正常硫辛酸組、假手術(shù)組、正常對照組明顯升高(P＜0.05），比電刺激硫辛酸低劑量組、電刺激硫辛酸高劑量組明顯降低(P＜0.05);bax蛋白癲癇組較正常硫辛酸組、假手術(shù)組、正常對照組、電刺激硫辛酸低劑量組、電刺激硫辛酸高劑量組明顯升高(P＜0.05）。bcl-2表達(dá)癲癇組較正常硫辛酸組、假手術(shù)組、正常對照組、電刺激硫辛酸低劑量組、電刺激硫辛酸高

10、劑量組明顯降低(P＜0.05)。
　　4、免疫組化結(jié)果癲癇組:大鼠海馬CA1區(qū)BDNF的平均光密度值較正常硫辛酸組、假手術(shù)組、正常對照組明顯升高(P＜0.05);bax的平均光密度值較正常硫辛酸組、假手術(shù)組、正常對照組顯著升高(P＜0.05）。與癲癇組相比，電刺激硫辛酸低劑量組、電刺激硫辛酸高劑量組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF、bcl-2的平均光密度值顯著升高(P＜0.05);bax的平均光密度值顯著降低(P＜0.05）。
　　

11、結(jié)論:
　　1、本實驗采用慢性杏仁基底外側(cè)核電刺激的方法成功建立了慢性電點燃癲癇模型，α-硫辛酸有效抑制電點燃致癇大鼠的癲癇發(fā)作，可以降低癲癇發(fā)作級別。
　　2、癲癇可降低抗凋亡蛋白bcl-2在海馬的表達(dá)，增加細(xì)胞凋亡蛋白bax表達(dá)。并上調(diào)BDNF的表達(dá)。
　　3、α-硫辛酸能夠上調(diào)BDNF、bcl-2表達(dá)，降低Bax的表達(dá)，推測癲癇后α-硫辛酸可能通過上調(diào)BDNF、bcl-2表達(dá)，降低Bax的表達(dá)，阻止細(xì)胞凋亡途徑來