CRF對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的直接效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、應(yīng)激是在生物學(xué)上被定義為各種生理學(xué)的改變，包括內(nèi)環(huán)境失穩(wěn)態(tài)及腦下垂體腎上腺軸的激活。在應(yīng)激條件下促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(Corticotropin releasing Factor，CRF)由下丘腦釋放，激活下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamus pituitarydrenal axis，HPA軸)，在正常情況下，負(fù)反饋回路能抑制CRF的進(jìn)一步合成和釋放，而在HPA軸調(diào)節(jié)發(fā)生異常時(shí)則會(huì)引起負(fù)反饋功能障礙，過度增加的血漿糖皮質(zhì)

2、激素合成釋放，最后會(huì)進(jìn)入中樞造成神經(jīng)元的損傷。然而目前的研究發(fā)現(xiàn)，CRF除了通過HPA軸引起神經(jīng)元損傷外，還可通過與中樞CRF受體作用引起海馬神經(jīng)元損傷。因此探索CRF對(duì)海馬神經(jīng)元的損傷作用及可能機(jī)制，可為應(yīng)激損傷中樞神經(jīng)元的分子機(jī)制提供新理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:
　　系統(tǒng)研究CRF通過CRFR1受體后信號(hào)通路直接導(dǎo)致中樞神經(jīng)元損傷的分子機(jī)制，旨在揭示與慢性應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)精神疾病的病理生理機(jī)制，為最終闡明慢性應(yīng)激損傷中樞

3、神經(jīng)元的分子機(jī)制提供新理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、免疫熒光法分析CRF對(duì)海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的影響:培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞至第五天，CRF(0.02μM，0.2μM，2μM)處理原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元，繼續(xù)培養(yǎng)至第十天。顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，然后用絲裂原活化蛋白-2(Mitogen ActivatedProtein，MAP2)標(biāo)記海馬神經(jīng)元樹突，免疫熒光法觀察海馬神經(jīng)元樹突的變化。用CRFR1特異性拮抗

4、劑(DMP696)處理海馬神經(jīng)元細(xì)胞，同樣顯微鏡下觀察對(duì)照組、CRF處理組和CRF+特異性拮抗劑(DMP696)海馬神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，然后用MAP2標(biāo)記海馬神經(jīng)元樹突，免疫熒光法觀察海馬神經(jīng)元樹突的變化。
　　2、磺酰羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)法檢測CRF對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響:培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞至第五天，加入不同濃度的CRF處理海馬神經(jīng)元細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為:空白組（無細(xì)胞），對(duì)照組（不加藥物組）

5、，CRF（0.02μM，0.2μM，2μM）處理組。培養(yǎng)至第十天SRB法測細(xì)胞活力。
　　3、Western Blot分析與神經(jīng)元生長密切相關(guān)的關(guān)鍵分子蛋白水平的變化:培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞至第五天，CRF(0.02μM，0.2μM，2μM)處理原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元，繼續(xù)培養(yǎng)至第十天。WesternBlot分析cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB)，微管

6、相關(guān)蛋白(microtubule asso-ciated proteins，Tau)磷酸化水平的變化，及MAP2，突觸后密度蛋白-95(Postsynapticdensity-95，PSD95)蛋白水平的變化，觀察CRF是否對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的以上幾種蛋白的水平產(chǎn)生影響。然后在原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元上，分別利用蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、磷脂肌醇(protein kinase C，PKC)、絲裂原活化蛋白激酶

7、(mitogen-activatedprotein kinase，MAPK)、1，4，5-三磷酸肌醇(Inositol1，4，5-triphophate，IP3)、磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)的特異性抑制劑H89、Calphostisc、PD98059、2-APB、U-73122與CRF共孵育，Western Blot檢測CREB，Tau磷酸化水平的變化，及MAP2，PSD95蛋白水平的變化，分析參與這種變化的信號(hào)

8、通路。
　　4、RT-PCR法分析與神經(jīng)元生長密切相關(guān)的關(guān)鍵分子mRNA表達(dá)水平的變化:培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞至第五天，用CRF及DMP696處理原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元，繼續(xù)培養(yǎng)至第十天。RT-PCR法檢測CREB、Tau、MAP2、PSD95 mRNA表達(dá)的變化。分析以上幾種分子的mRNA變化情況。
　　5、環(huán)磷酸腺苷（Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP）釋放試驗(yàn)檢測海馬神經(jīng)元細(xì)胞cA

9、MP含量的變化:培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞至第十天，cAMP釋放試驗(yàn)檢測CRF刺激海馬神經(jīng)元細(xì)胞釋放cAMP的含量變化，并檢測DMP696對(duì)CRF刺激海馬神經(jīng)元細(xì)胞釋放cAMP含量的影響。分析cAMP是否參與了CRFR1介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的損傷作用。
　　結(jié)果:
　　1、2μM CRF可引起海馬神經(jīng)元樹突密度減少，用特異性拮抗劑(DMP696)處理細(xì)胞，CRF可引起海馬神經(jīng)元樹突密度減少的作用明顯被拮抗。
　　2、CRF對(duì)海

10、馬神經(jīng)元細(xì)胞活力產(chǎn)生抑制，CRF（0.2μM，2μM）處理組細(xì)胞活力依次為71.6±3.1％，72.6±3.5％(n=3，***P＜0.001與對(duì)照組相比)。
　　3、2μM CRF可下調(diào)海馬神經(jīng)元細(xì)胞MAP2，P-CREB蛋白水平，上調(diào)PSD95，P-Tau蛋白水平;CRFR1特異性拮抗劑(DMP696)可拮抗CRF引起的MAP2，P-CREB蛋白水平下調(diào)及PSD95，P-Tau蛋白水平上調(diào);PKA特異性抑制劑H89可拮抗CRF

11、引起的MAP2蛋白水平下調(diào)及P-Tau蛋白水平上調(diào)。
　　4、海馬神經(jīng)元細(xì)胞中PSD95，MAP2的mRNA表達(dá)水平的變化與蛋白水平的變化一致，Tau與CREB的mRNA表達(dá)水平無明顯變化。
　　5、cAMP釋放試驗(yàn)表明CRF可濃度依賴性的調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元細(xì)胞cAMP含量的變化(EC50=(3.157±0.133)×10-9M，n=3），并且特異性拮抗劑DMP696可減少2μMCRF引起的海馬神經(jīng)元cAMP釋放水平（n=3，*