PTSD藍(lán)斑神經(jīng)元骨架蛋白表達(dá)與β-catenin信號(hào)調(diào)控細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的:
　　 創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)是指由異常威脅性或?yàn)?zāi)難性心理創(chuàng)傷導(dǎo)致延遲出現(xiàn)和長(zhǎng)期持續(xù)的精神障礙。其特征性的癥狀為病理性重現(xiàn)創(chuàng)傷體驗(yàn)、持續(xù)性警覺(jué)增高、持續(xù)性回避、對(duì)創(chuàng)傷性經(jīng)歷的選擇性遺忘以及對(duì)未來(lái)失去信心等。隨著現(xiàn)代社會(huì)交通傷亡、暴力事件等社會(huì)應(yīng)激事件的增多和自然災(zāi)害(如地震、火山、洪水等)的發(fā)生,PTSD已經(jīng)成為影響創(chuàng)傷救治整體水平的重要因素之一,嚴(yán)重干擾了人民生活和社會(huì)秩序而備受關(guān)注。
　　 應(yīng)激反應(yīng)主要由交

2、感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(SAS)的快速激活和下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPAaxis)的興奮激活來(lái)激發(fā),且二者之間存在著協(xié)同性。許多研究顯示,PTSD患者其血、尿中的最終靶激素-糖皮質(zhì)激素(glicocorticoid,GC)水平卻低于正常;與此同時(shí),SAS則表現(xiàn)出高活動(dòng)性。因此,PTSD患者中可能存在著HPA與SAS的“分離”現(xiàn)象,即GC不能限制、調(diào)節(jié)SAS反應(yīng),導(dǎo)致兒茶酚胺(由SAS釋放)所致的記憶加強(qiáng)。藍(lán)斑(locuscoeruleus,

3、LC)主要由去甲腎上腺素能細(xì)胞構(gòu)成,是腦內(nèi)去甲腎上腺素能細(xì)胞的主要集中地,參與調(diào)節(jié)植物性神經(jīng)活動(dòng)。藍(lán)斑能纖維影響中樞所有區(qū)域的神經(jīng)活動(dòng),與排尿、學(xué)習(xí)記憶、嗅行為、呼吸、循環(huán)、泌尿、針刺鎮(zhèn)痛和睡眠(調(diào)節(jié)異相睡眠)等機(jī)能有關(guān)。此外,藍(lán)斑可通過(guò)其廣泛傳出聯(lián)系維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的覺(jué)醒狀態(tài)。
　　 藍(lán)斑對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)是經(jīng)藍(lán)斑到杏仁核、海馬的通路,通過(guò)激活邊緣系統(tǒng)來(lái)完成。目前基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明:在一個(gè)創(chuàng)傷后藍(lán)斑通路經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的強(qiáng)化,特別在應(yīng)激

4、的狀態(tài)下,成為重復(fù)闖入性再體驗(yàn)的基礎(chǔ),這一現(xiàn)象是研究PTSD疾病的一個(gè)突破口。細(xì)胞骨架蛋白的變化勢(shì)必會(huì)影響細(xì)胞的功能,并有可能啟動(dòng)神經(jīng)元的自殺程序,引起凋亡。生長(zhǎng)錐蛋白是凋亡相關(guān)蛋白,生長(zhǎng)錐蛋白-紐蛋白(vinculin)是重要的凋亡蛋白?？p隙連接蛋白(Connexin43,Cx43)和整合素(Lntegrin)是細(xì)胞間連接蛋白,在細(xì)胞凋亡中也出現(xiàn)相應(yīng)的改變。Caspase-12(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡途徑的

5、關(guān)鍵凋亡因子。Nakagawa等證實(shí)caspase-12)存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,他在誘導(dǎo)細(xì)胞ERS(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激)實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,而caspase-12基因缺乏細(xì)胞經(jīng)ERS反應(yīng)時(shí),細(xì)胞凋亡受抑制,說(shuō)明caspase-12是ERS反應(yīng)誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵分子。PTSD是引起細(xì)胞應(yīng)激性反應(yīng),故檢測(cè)caspase-12表達(dá)變化是否引起細(xì)胞凋亡。
　　 β-catenin(β-連環(huán)蛋白)是wnt通路中的關(guān)鍵因子,Wnt通路與多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存

6、在“對(duì)話”,參與多種細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)。它可以通過(guò)多種機(jī)制來(lái)控制細(xì)胞的凋亡,Rhee等研究發(fā)現(xiàn),在一些細(xì)胞受損發(fā)生凋亡時(shí),Wnt通路通過(guò)β-catenin/Tcf的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)途徑來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Wnt通路也可以抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C從而抑制細(xì)胞凋亡。
　　 “單一連續(xù)刺激(singleprolongedstress,SPS)”SPS動(dòng)物模型是目前探討PTSD發(fā)病機(jī)制的較理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?該方法已經(jīng)被國(guó)際所認(rèn)同。因此本研究采用

7、PTSDSPS模型,采用免疫組織化學(xué)、Western及RT-PCR方法,從蛋白和分子水平檢測(cè)整合素、縫隙連接蛋白、紐蛋白及β-catenin,并用RT-PCR方法檢測(cè)caspase-12mRNA的改變,旨在探討PTSD藍(lán)斑神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致功能紊亂的發(fā)生機(jī)制,為揭示PTSD的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、模型制作及分組
　　 采用2005年日本文部省召開(kāi)的國(guó)際PTSD科學(xué)會(huì)議確定的SPS模型。其

8、具體方法是將大鼠按下述步驟連續(xù)進(jìn)行處理:固定刺激2h;強(qiáng)迫性游水20min,水深40cm,水溫25℃;休息15min;乙謎麻醉至意識(shí)喪失;無(wú)干擾空間常規(guī)喂養(yǎng)。隨機(jī)分為5組,即正常對(duì)照組及SPS1d、4d、7d、和14d組。
　　 2、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)整合素、縫隙連接蛋白、紐蛋白及β-catenin的表達(dá)
　　 免疫組化:分別選取各組大鼠灌流固定、沉糖的大腦,制作石蠟切片,分別用SABC法進(jìn)行藍(lán)斑的骨架蛋白、β-cat

9、enin免疫組織化學(xué)染色,DAB顯色,中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡觀察,攝片。
　　 3、WesternBlotting方法檢測(cè)整合素、縫隙連接蛋白、紐蛋白及β-catenin的表達(dá)
　　 WesternBlotting:分別取新鮮藍(lán)斑經(jīng)勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心,提取上清蛋白,電泳,轉(zhuǎn)膜,經(jīng)封閉后分別加一抗4℃過(guò)夜;HRP標(biāo)記IgG孵育2h,ECL發(fā)光,檢測(cè)條帶各光密度值。
　　 4、RT-PCR法檢測(cè)整合素、縫

10、隙連接蛋白、β-catenin及Caspase-12的mRNA表達(dá)
　　 RT-PCR:斷頭取腦分離藍(lán)斑,提取總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳,成像并進(jìn)行積分光密度分析。
　　 5、透射電鏡技術(shù)觀察藍(lán)斑神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變
　　 常規(guī)電鏡制樣,倒扣包埋、聚合、半薄切片定位,AO超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片,透射電鏡下觀察。
　　 結(jié)果:
　　 1、整合素、縫隙連接蛋白的免疫組化、W

11、esternBlotting及RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果
　　 陽(yáng)性細(xì)胞均在細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá),各項(xiàng)表達(dá)均于SPS4d達(dá)高峰,SPS7d和SPS14d逐漸下降。
　　 2、β-catenin免疫組化、WesternBlotting的檢測(cè)結(jié)果
　　 β-catenin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在SPS各組細(xì)胞胞質(zhì)中,各項(xiàng)表達(dá)呈逐漸下調(diào)趨勢(shì)。
　　 3、透射電鏡技術(shù)觀察藍(lán)斑神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變
　　 SPS后,藍(lán)斑神經(jīng)元發(fā)生

12、了超微結(jié)構(gòu)改變,核內(nèi)染色質(zhì)濃縮邊集。核膜下陷,核皺縮,出現(xiàn)凋亡的特征性結(jié)構(gòu)改變。
　　 4、凋亡因子Caspase-12RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果
　　 SPS刺激后,Caspase-12mRNA表達(dá)于1d表達(dá)明顯增加,4d時(shí)表達(dá)最多,之后漸趨下降。
　　 結(jié)論:
　　 1、PTSD大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元整合素、縫隙連接蛋白及紐蛋白的表達(dá)變化與藍(lán)斑神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡相關(guān)。
　　 2、PTSD大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元各時(shí)間