脂多糖對(duì)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、研究目的：
　　 肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉淀的一個(gè)病理過(guò)程。許多肝臟慢性炎癥疾病如慢性乙型和丙型病毒性肝炎、慢性酒精性肝炎、自身免疫性肝炎和原發(fā)性硬化性膽管炎等均可引起肝纖維化。肝纖維化作為肝臟對(duì)損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，其中心環(huán)節(jié)是肝臟炎癥反應(yīng)激活肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)，活化的HSC增殖加快，分泌大量膠原在細(xì)胞外基質(zhì)(extracellu

2、larmatrix，ECM)過(guò)多沉積。目前，研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化為一動(dòng)態(tài)發(fā)展的可逆性病變，活化的HSC的凋亡是肝纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)的重要原因。
　　 活化的HSC凋亡主要受到神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nervegrowthfactor，NGF)的調(diào)節(jié)：肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的慢性損傷時(shí)，一方面釋放并激活各種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，形成“炎性瀑布”，通過(guò)旁分泌途徑促進(jìn)HSC的活化、增殖，TLR4/NF-κB軸在炎癥促肝纖維化發(fā)生中起著核心作用；另一方面，肝細(xì)胞會(huì)釋放

3、NGF，與活化HSC細(xì)胞上的受體p75NTR結(jié)合，誘導(dǎo)活化HSC凋亡，抑制膠原纖維的“過(guò)度”沉積，調(diào)節(jié)肝纖維化的進(jìn)展。慢性肝病-肝纖維化發(fā)生過(guò)程中，循環(huán)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)增多，主要與其受體TLR2/TLR4結(jié)合，通過(guò)TLR4/NF-κB軸促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生。肝纖維化的發(fā)生是活化HSC增殖/凋亡失衡的結(jié)果。那么，LPS-TLR2/TLR4-NF-κB是否對(duì)活化HSC凋亡有何影響呢?這值得我們進(jìn)一步研究。

4、已有研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR的表達(dá)受到TLR相關(guān)的MyD88依賴(lài)性信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。因此，我們推測(cè)肝纖維化發(fā)生時(shí)，高表達(dá)LPS一方面抑制肝細(xì)胞NGF的分泌，另一方面通過(guò)TLR-MyD88-NF-κB軸抑制p75NTR表達(dá)及凋亡相關(guān)通路，抑制活化HSC的凋亡，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生與進(jìn)展。
　　 本研究擬通過(guò)建立大鼠肝纖維化模型，觀察血漿脂多糖濃度；分析其與肝纖維化的關(guān)系；分離大鼠HSC，體外LPS激活HSC的TLR4表達(dá)，siRNA干擾

5、MyD88信號(hào)分子，阻斷NF-κB，觀察HSC對(duì)NGF誘導(dǎo)凋亡的反應(yīng)，探討TLR4調(diào)控的先天免疫反應(yīng)對(duì)NGF誘導(dǎo)的HSC凋亡過(guò)程的影響：同時(shí)分離大鼠肝細(xì)胞，研究LPS對(duì)肝細(xì)胞NGF分泌的影響，從而說(shuō)明TLR激活的相關(guān)途徑在HSC凋亡中的作用，這將為炎癥對(duì)肝纖維化進(jìn)展及纖維化的逆轉(zhuǎn)的調(diào)控機(jī)制提供新的思路與方法。
　　 研究方法:
　　 采用兩種致大鼠肝纖維化模型，分別為二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，

6、DMN)腹腔注射4周所致化學(xué)損傷型肝纖維化模型(10μg/kg，每周連續(xù)3天)及膽管結(jié)扎(bileductligation，BDL)所致膽汁淤積性肝纖維化模型(約4周)，檢測(cè)各組血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alaninetransarninase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase，AST)、總膽紅素(totalbilirubin，TB)、直接膽紅素(conjugatedbilirubin，DB

7、)、凝血酶時(shí)間(prothrombintime，PT)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltranspeptidase，γ-GGT)；伊紅(hematoxylinandeosin，HE)染色、Masson染色及苦味酸酸性復(fù)紅(vangieson，VG)染色評(píng)估各組肝纖維化病理進(jìn)程，研究?jī)煞N不同機(jī)制所致肝纖維化大鼠的血漿脂多糖的濃度的變化；采用原位酶消化-密度梯度離心分離大鼠肝星狀細(xì)胞，體外脂多糖(LPS)(10μg/ml)不同時(shí)間(

8、30min、1h、6h、12h)作用HSC，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)不同濃度(50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)作用HSC24小時(shí)，確定LPS最佳作用時(shí)間和NGF最佳作用濃度；用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖，LPS作用HSC1小時(shí)后，NGF繼續(xù)作用HSC24小時(shí)，用流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Realtime-PCR與Western-blot分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)；并用MyD88SiRNA和抑制劑BAY

9、分別干擾MyD88途徑及阻斷NF-κB信號(hào)通路，檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其受體表達(dá)。同時(shí)分離大鼠肝細(xì)胞，研究LPS對(duì)肝細(xì)胞NGF分泌的影響及肝細(xì)胞對(duì)活化HSC凋亡的影響。
　　 結(jié)果:
　　 一、肝纖維化與血漿LPS的關(guān)系
　　 1、與正常大鼠比較，BDL組模型大鼠血清PT、AST、TB、DB及γ-GGT明顯增高(P＜0.05或P＜0.01)；ALB明顯降低(P＜0.05)；ALT

10、水平無(wú)明顯變化。與正常大鼠比較，DMN組大鼠(4w)，血清PT、AST、TB、DB及γ-GGT均明顯增高(P＜0.05或P＜0.01)；ALB明顯降低(P＜0.05)；ALT水平無(wú)明顯變化。
　　 2、與正常大鼠比較，BDL模型大鼠血漿LPS濃度明顯增高(P＜0.01)；不同時(shí)間DMN模型組大鼠(2w、3w、4w)LPS濃度明顯增高(P＜0.05或P＜0.01)，并且第4周的LPS濃度最高(P＜0.01)。
　　 二、脂

11、多糖對(duì)活化肝星狀細(xì)胞凋亡的影響
　　 1.成功分離、鑒定、培養(yǎng)HSC，LPS(10μg/ml)作用活化HSC不同時(shí)間(30min、1h、6h、12h)，LPS作用1h能明顯促進(jìn)TLR4、MyD88mRNA及TRAFmRNA水平的表達(dá)(P＜0.01)；不同濃度的NGF(50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)作用HSC24小時(shí)，發(fā)現(xiàn)NGF(200ng/ml)作用24h明顯促進(jìn)HSC凋亡，明顯促進(jìn)fas、bax、p53及

12、p75NTR的mRNA水平的表達(dá)(P＜0.05)，明顯抑制bcl-2mRNA水平的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 2.NGF(200ng/ml，24h)能明顯抑制HSC增殖(P＜0.01)，LPS(10μg/ml，1h)能明顯促進(jìn)HSC細(xì)胞增殖(P＜0.05)。
　　 3.流式細(xì)胞儀和FITC-TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS(10μg/ml，1h)能明顯抑制由NGF(200ng/ml，24h)誘導(dǎo)的HSC的凋亡(P＜0.05)；

13、
　　 4.RealtimePCR顯示LPS(10μg/ml，1h)能明顯抑制由NGF(200ng/ml，24h)誘導(dǎo)的bax、p53/p75NTR、NGF的mRNA水平的表達(dá)(P＜0.05)，明顯促進(jìn)NGF抑制的bcl-2mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 5.Westernblot顯示LPS(10μg/ml，1h)能明顯抑制由NGF(200ng/ml，24h)誘導(dǎo)的bax、p75NTR、NGF、cleaved-c

14、aspase3、cleaved-caspase9和PARP蛋白水平的表達(dá)(P＜0.05)，能明顯促進(jìn)NGF抑制的bcl-2蛋白水平的表達(dá)(P＜0.05)；
　　 三、MyD88依賴(lài)的NF-κB途徑在LPS抑制活化HSC凋亡中的作用
　　 1、抗TLR2、TLR4抗體作用HSC后，發(fā)現(xiàn)TLR4而不是TLR2抗體能明顯拮抗LPS對(duì)NGF誘導(dǎo)的HSC的凋亡相關(guān)蛋白cleavedcaspase3、cleavedcaspase9、

15、PARP及Bax的表達(dá)的抑制和p75NTR表達(dá)的抑制(P＜0.05)。
　　 2、LPS、MyD88siRNA對(duì)HSC凋亡沒(méi)有明顯影響；MyD88siRNA減少LPS對(duì)NGF誘導(dǎo)HSC凋亡的抑制(P＜0.05)；MyD88siRNA能減少LPS對(duì)NGF誘導(dǎo)的HSC凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、PARP及Bax的表達(dá)的抑制和p75NTR表達(dá)的抑制(P＜0.05)；且MyD88siR

16、NA能明顯抑制LPS作用HSC后p-IκB、p50和胞核p65蛋白水平的增加(P＜0.05)。
　　 3、用NF-κB通路抑制劑BAY作用HSC，LPS對(duì)NGF誘導(dǎo)的HSC凋亡現(xiàn)象的抑制作用和凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase-3、cleaved-caspase9、PARP、bax表達(dá)的抑制作用及p75NTR表達(dá)的抑制作用明顯減弱(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 四、LPS對(duì)肝細(xì)胞/星狀細(xì)胞共培養(yǎng)中HSC凋

17、亡的影響
　　 1、成功分離肝細(xì)胞，LPS作用肝細(xì)胞后，肝細(xì)胞NGFmRNA的表達(dá)和NGF蛋白的表達(dá)均較正常明顯減少(P＜0.05)；
　　 2、活化的HSC能誘導(dǎo)肝細(xì)胞分泌NGF，且肝細(xì)胞與活化HSC共培養(yǎng)能誘導(dǎo)HSC的凋亡(P＜0.05)。LPS作用后的肝細(xì)胞和活化HSC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)活化HSC凋亡明顯減少(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、肝纖維化形成過(guò)程中，血漿LPS濃度與肝纖維化發(fā)展成正相