雙環(huán)醇對肝星狀細(xì)胞增殖及凋亡的影響.pdf

1、慢性肝臟疾病是一類世界性的嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病，其中肝纖維化是這個過程的中間及關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝纖維化（hepatic fibrosis）是慢性肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，是形成肝硬化的必經(jīng)病理階段，其特征是以膠原為主的細(xì)胞外間質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分合成增多和/或降解相對不足而在肝內(nèi)過量沉積。盡管不同肝病的發(fā)病機(jī)制有所不同，但其發(fā)生纖維化的最終途徑相似，其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞（hepatic stel

2、late cells，HSCs）的激活。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是啟動整個事件的開端，在肝纖維化過程中扮演著重要的角色，誘導(dǎo)活化HSC的凋亡可使肝纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)。越來越多的研究認(rèn)為HSC活化和增殖與其凋亡受到抑制有關(guān)，而核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。NF-κB是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子κB序列特異合的蛋白因子，由Rel蛋白家

3、族的成員以同源或異源二聚體形式組成，目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動物的Rel蛋白包括p65（RelA，NF-κB3）、p50（NF-κB1）、Rel（c-Rel）、RelB和p52（NF-κB2：），其中p65/p50是發(fā)現(xiàn)最早的，分布最廣泛，主要發(fā)揮生理作用的NF-κB。NF-κB能與多種細(xì)胞基因啟動子或增強(qiáng)子序列特定位點發(fā)生特異性結(jié)合而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答以及細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的病理生理過程密切相關(guān)。誘導(dǎo)活化HSC的凋亡

4、可使肝纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)。
　　 雙環(huán)醇是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制的抗肝炎新藥，其化學(xué)名稱為6-甲氧羰基15-羥甲基-2，3，2，3-雙亞甲二氧基4，4-二甲氧基聯(lián)苯。以往研究表明，雙環(huán)醇對多種實驗性急、慢性肝損傷均有明顯保護(hù)作用。臨床用于治療慢性乙型、丙型病毒性肝炎已取得較好療效.且具有口服吸收好、不良反應(yīng)少的特點，除此之外，雙環(huán)醇還可使肝纖維化大鼠血清ALT、AST、總膽紅素、透明質(zhì)酸（HA）和Ⅲ型前膠原肽（PⅢP）水平明顯

5、降低，白蛋白水平顯著增高.提示我們雙環(huán)醇可能通過下調(diào)HSC內(nèi)NF-κB的基因表達(dá)，從而使HSC的凋亡增加，減緩肝纖維化的進(jìn)程。本文的主要目的是研究雙環(huán)醇對實驗性HSC是否具有抗凋亡作用，從而為擴(kuò)大雙環(huán)醇臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 目的：本實驗通過設(shè)計用不同濃度的雙環(huán)醇對體外培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞的作用，研究其對腫瘤壞死因子-α（TNF-a）激活的肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞，進(jìn)行以下分組：

6、按下列分組進(jìn)行處理：①對照組；②TNFa組；③雙環(huán)醇組④TNF-a+雙環(huán)醇。
　　 應(yīng)用電泳遷移率改變實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）測定NF-κB活性變化；免疫熒光染色法（抗大鼠Cy3）測定NF-κB在HSCs中的分布；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriotion polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測基質(zhì)金屬蛋白酶抑制

7、因子-1（Timp-1）的mRNA的表達(dá)；MTT方法測定HSCs增殖率；末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標(biāo)記法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）檢測細(xì)
　　 結(jié)果：
　　 1.EMSA顯示對照組即可檢測出較高的NF-κB結(jié)合活性，TNF-a刺激后，NF-κB結(jié)合活性升高明顯（P<0.01

8、）；雙環(huán)醇干預(yù)后，雙環(huán)醇組的NF-κB結(jié)合活性明顯下降（P<0.01）；TNF-a+雙環(huán)醇組亦可檢測出較高的NF-κB結(jié)合活性，與TNF-a組比較無明顯減低，（P>0.05）.
　　 2.免疫細(xì)胞熒光染色法顯示：對照組及TNF-a組NF-κB陽性細(xì)胞較多，細(xì)胞形態(tài)正常，且在熒光顯微鏡下可以觀察到紅色的熒光，TNF-a組觀察到紅色的熒光強(qiáng)度高于對照組；雙環(huán)醇組陽性細(xì)胞減少，并出現(xiàn)濃染致密的凋亡細(xì)胞。
　　 3.反轉(zhuǎn)錄聚合酶

9、鏈反應(yīng)顯示：0.5mmol/L雙環(huán)醇組的HSC Timpl的mRNA表達(dá)減低，較TNF-a組顯著減低（P<0.01），與對照組及TNF-a+雙環(huán)醇組比較均減低，表明經(jīng)0.5mmol·L-雙環(huán)醇干預(yù)后Timpl的mRNA表達(dá)減低。
　　 4.MTT方法測定顯示，與對照組相比TNF-a組在24h，48h和72h都有明顯差異，雙環(huán)醇組在48h（P<0.05）有明顯差異。與TNF-a組相比雙環(huán)醇組在24h，48h和72h都有明顯差異，T

10、NF-a和雙環(huán)醇合用組在24h，48h和72h亦有明顯差異。
　　 5.雙環(huán)醇作用后的TNF-a激活的HSC凋亡增加：TUNEL法結(jié)果顯示24h，48h，72h三組0.5mmol·L雙環(huán)醇組細(xì)胞凋亡較TNF-a組增加（P<0.01），而48h，72h兩組之間的凋亡率無明顯差異（P>0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，TNF-a可以刺激HSCs增殖并促進(jìn)NF-κB蛋白含量及結(jié)合活性的表達(dá)；雙