灰樹花多糖對(duì)四氯化碳肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、化學(xué)性肝損傷已成為繼病毒性肝損傷之后的第二大肝病誘因，目前臨床應(yīng)用的500～1000余種中西藥物以及多種化學(xué)藥品，均可引起不同程度的肝病。據(jù)國(guó)內(nèi)外資料報(bào)道，有20％的暴發(fā)性肝衰竭由化學(xué)藥物引起。近年來，化學(xué)性肝損傷呈增加趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人們的生命健康。但目前臨床上仍缺乏有效的防治藥物，因而加強(qiáng)肝臟損傷保護(hù)研究、開展對(duì)化學(xué)性肝病的防護(hù)工作，對(duì)于提高人類健康水平具有重要意義。
　　 四氯化碳(carbon tetrachloride，

2、CCl4)肝損傷是經(jīng)典的肝損傷模型，CC14對(duì)肝臟具有較強(qiáng)的損傷作用，可導(dǎo)致肝細(xì)胞的脂肪變性、壞死、纖維化，因此，被廣泛用來制作體內(nèi)、外肝損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 灰樹花多糖(Polysaccharide of Grifola Frondosa，PGF)是從一種大型真菌灰樹花(Grifola frondosa)子實(shí)體或菌絲內(nèi)提取的一種真菌多糖，其活性基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)為具有高度分支的β-1，3-葡聚糖和β-1，6-葡聚糖。藥理分析表明灰樹花多

3、糖具有明顯的抗腫瘤、改善免疫系統(tǒng)功能、調(diào)節(jié)血糖、血脂及膽固醇水平、清除氧自由基等作用。但有關(guān)灰樹花多糖對(duì)肝損傷的保護(hù)及其機(jī)制研究尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　 通過體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探討PGF對(duì)四氯化碳(CC14)誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞（組織）損傷保護(hù)作用及其機(jī)制，為PGF在肝損傷性疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 (1)培養(yǎng)L-02細(xì)胞，以60％飽和CC14損傷液建立穩(wěn)定的CC14肝細(xì)胞損傷模型；
　　 (2)細(xì)胞分為六組：正常對(duì)

4、照組、CC14損傷組、不同濃度的PGF保護(hù)組(50μg/ml，lOOμg/ml，200μg/ml，400μg/m1)，PGF于損傷前12小時(shí)加入。
　　 (3)Giemsa染色法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察。
　　 (4) MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性的影響；
　　 (5)分光光度法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的活性；
　　 (6)分光光度法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)

5、含量和總超氧化物岐化酶(SOD)活力的變化；
　　 (7)激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化；
　　 (8)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位（Rh123對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色）
　　 (9)Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax表達(dá)量
　　 (1)建立小鼠急性肝損傷模型；
　　 (2)將小鼠分為8組：空白對(duì)照組，CC14損傷組，6組不同濃度PGF保護(hù)組(4.5mg

6、/kg,9mg/kg,18mg/kg,36mg/kg,72mg/kg,144mg/kg);
　　 (3)肝組織石蠟切片、HE染色法，觀察肝臟組織的組織病理學(xué)變化；
　　 (4)血清轉(zhuǎn)氨酶活性檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的活性變化；
　　 (5)肝組織勻漿生化檢測(cè)肝細(xì)胞勻漿液中丙二醛( MDA)含量和總超氧化物岐化酶(SOD)活力的變化；
　　 (6)Western blo

7、t法檢測(cè)肝組織勻漿中bcl-2、bax含量的變化。
　　 (1)形態(tài)學(xué)觀察正常組L-02細(xì)胞呈不規(guī)則多角形，立體感強(qiáng)，形態(tài)飽滿；細(xì)胞核圓形，位于細(xì)胞中央，約占細(xì)胞體積的二分之一，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后呈鋪路石狀。損傷組細(xì)胞，立體感沒有正常組強(qiáng)，而且有較多的細(xì)胞發(fā)生凋亡；而各PGF保護(hù)組細(xì)胞，存活狀態(tài)均優(yōu)于損傷組細(xì)胞，以lOOμg/ml保護(hù)組效果最佳。
　　 (2)MTT法分析：與CC14損傷組（細(xì)胞相對(duì)存活率32.31％）相比，

8、PGF保護(hù)組可維持較高的細(xì)胞相對(duì)存活率，在50～100μg/ml范圍內(nèi)，對(duì)CC14損傷的保護(hù)效果隨PGF作用濃度的增高而增強(qiáng)，最佳保護(hù)濃度為100μg/ml，細(xì)胞相對(duì)存活率達(dá)74.92％：
　　 以下指標(biāo)中保護(hù)組均為最佳濃度（100μg/ml）保護(hù)的結(jié)果。
　　 (3)培養(yǎng)液上清轉(zhuǎn)氨酶活性檢測(cè)：
　　 ①AST活性：正常組70.11(IU/L)，損傷組152.16(IU/L)，保護(hù)組78.47(IU/L)；

9、>　　 ②ALT活性：正常組35.26(IU/L)，損傷組96.47(IU/L)，保護(hù)組44.39(IU/L)。
　　 (4)細(xì)胞SOD、MDA檢測(cè)：
　　 ①SOD活力：正常組121.94U/mgprot，損傷組56.55 U/mgprot，保護(hù)組112.67 U/mgprot;
　　 ②MDA含量：正常組2.14nmol/mgprot，損傷組5.19 nmol/mgprot，保護(hù)組2.55 nmol/mgp

10、rot（與正常對(duì)照組1P＞0.05）；
　　 (5)細(xì)胞內(nèi)游離Ca+的相對(duì)濃度：正常組為302.6、損傷組2393.4、保護(hù)組529.4。
　　 (6)線粒體膜電位(△ψm)測(cè)量：正常組為455.17、損傷組為96.26和保護(hù)組為248.75;
　　 (7)Western-blot檢測(cè)結(jié)果：將Western-blot檢測(cè)結(jié)果圖采用NIH系統(tǒng)Image J圖像分析軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示：
　　 ①

11、Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量：正常組為1.53，損傷組為0.16，保護(hù)組1.20。
　　 ②Bax的相對(duì)表達(dá)量：正常組為0.4，損傷組為1.01，保護(hù)組為0.71。
　　 2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 (1)肝臟形態(tài)學(xué)觀察：正常對(duì)照組小鼠肝臟顏色鮮紅，質(zhì)地柔軟；純損傷組小鼠肝臟體積增大，呈土黃色，質(zhì)地變硬，或可見針尖樣大小結(jié)節(jié)；各PGF保護(hù)組小鼠肝臟形態(tài)介于正常對(duì)照組與純損傷組之間，保護(hù)效果明顯
　　 (2)病理學(xué)觀

12、察：正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)正常，無炎細(xì)胞浸潤(rùn)。CC14損傷組肝竇內(nèi)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝索排列紊亂，中央靜脈周圍大片肝細(xì)胞細(xì)胞腫脹。各PGF保護(hù)組肝細(xì)胞壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)基本正常；
　　 以下指標(biāo)中保護(hù)組均為最佳濃度(72mg/kg)保護(hù)的結(jié)果。
　　 (3)血清酶學(xué)檢測(cè)：
　　 ①AST活性：正常組30.52(IU/L)，損傷組142.87(IU/L)，保護(hù)組4

13、3.69(IU/L)（與正常對(duì)照組P>0.05）；
　　 ②ALT活性：正常組15.18(IU/L)，損傷組218.37(IU/L)，保護(hù)組57.42(IU/L);
　　 (4)肝勻漿組織化學(xué)檢測(cè)：
　　 ①SOD含量：正常組93.44U/mgprot，損傷組47.28 U/mgprot，保護(hù)組88.47U/mgprot；
　　 ②MDA含量：正常組3.62nmol/mgprot，CCl4損傷組7.83

14、nmol/mgprot，保護(hù)組4.51 nmol/mgprot;
　　 (5)Western-blot檢測(cè)結(jié)果：將Western-blot檢測(cè)結(jié)果圖采用NIH系統(tǒng)Image J圖像分析軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示：
　　 ①Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量：正常組為1.05，損傷組為0.21，保護(hù)組為0.95;
　　 ②Bax的相對(duì)表達(dá)量：正常組為0.27，損傷組為0.87，保護(hù)組為0.51;
　　 1、建立了

15、飽和CC14損傷液體外損傷肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?br>　　 2、確定了PGF對(duì)CCl4誘導(dǎo)的體外肝細(xì)胞損傷具有顯著保護(hù)作用，最佳保護(hù)濃度為100μg/ml;
　　 3、PGF可通過抑制肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高及改變凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的表達(dá)水平，影響線粒體相關(guān)的凋亡信號(hào)傳遞過程，有效地防止線粒體膜電位的下降和一系列下游事件的發(fā)生，減少細(xì)胞凋亡；
　　 4、確定了PGF對(duì)CCl4誘導(dǎo)的體內(nèi)肝細(xì)胞損傷的最佳保護(hù)濃度