谷氨酰胺對四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用及意義.pdf

1、谷氨酰胺(GLN)是人體內(nèi)含量最為豐富的游離氨基酸，是重要的氮運(yùn)載體和供體，在機(jī)體對氨的解毒作用中發(fā)揮著重要功能。同時(shí)，GLN還是嘌呤、嘧啶、蛋白質(zhì)、核苷酸以及抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)等物質(zhì)的前體。GLN是一種非必需氨基酸，機(jī)體許多組織都能合成，但在劇烈運(yùn)動、創(chuàng)傷、感染等應(yīng)激和高分解狀態(tài)下，GLN的需要量大大超過了機(jī)體合成GLN的能力，此時(shí)機(jī)體GLN含量降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成減少，影響許多組織和細(xì)胞包括肝臟、腸道、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免

2、疫細(xì)胞和胰腺β細(xì)胞的功能。肝臟是機(jī)體內(nèi)具有多種代謝功能的重要器官，肝組織內(nèi)同時(shí)含有GLN合成酶和GLN酶，既能合成又能分解GLN，肝臟GLN的代謝在控制外周靜脈血中氨的水平起著十分重要的作用。補(bǔ)充外源性GLN，可通過參與能量代謝、增加肝臟細(xì)胞能量代謝底物負(fù)荷以及保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)與功能等過程，減少氧自由基的產(chǎn)生與釋放，從而減少肝臟GSH的消耗；可增加ATP含量；能刺激糖原合成，提高肝細(xì)胞糖原儲備；可抑制核因子-κB(NF-κB)的活性以及

3、與之相關(guān)的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的釋放，抑制炎性因子的釋放以及中性粒細(xì)胞在局部的聚集，減輕內(nèi)毒素血癥的損害與氧自由基的釋放；抑制肝細(xì)胞凋亡和脹亡。近年來發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞脹亡在肝細(xì)胞損傷中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過四氯化碳(CCL4)致大鼠急性肝損傷模型，研究GLN在急性肝損傷中尤其是肝細(xì)胞凋亡和脹亡的保護(hù)作用及意義，為GLN的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷模型，50只SD大鼠隨

4、機(jī)分為3組：對照組(n=10)、模型組(n=20)、GLN干預(yù)組(n=20)。采用CCL4腹腔注射誘導(dǎo)急性肝損傷模型。分別于致傷后4、8、12、16、24h取大鼠血清，全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平；光鏡下觀察大鼠肝臟病理學(xué)改變；電鏡下觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞脹亡(oncosis)；免疫組織化學(xué)染色法檢測肝組織核因子-κB(NF-κB)的表達(dá)；RT-PCR方法檢測肝組織腫瘤壞死因子-

5、α(TNF-α)mRNA的表達(dá)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的2dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測肝細(xì)胞凋亡(apoptosis)。 通過檢測得出如下結(jié)果： 1.血清ALT、AST水平：注射CCL44h后，模型組大鼠血清ALT、AST較對照組明顯升高，兩者有顯著差異(P＜0.01)，后隨時(shí)相改變，ALT、AST水平逐漸上升，16h后達(dá)到高峰(ALT,1631.00±351.11；ASL2465.60±443

6、.45)。GLN干預(yù)組與對照組各時(shí)相平行比較，均有不同程度增高，但較模型組明顯降低(P＜0.05)。 2.組織病理學(xué)特征：模型組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝界板消失，肝細(xì)胞大片狀壞死，有不同程度炎性細(xì)胞侵潤。GLN干預(yù)組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，胞漿出現(xiàn)空泡，少量炎性細(xì)胞侵潤。電鏡下模型組肝細(xì)胞核出現(xiàn)融解性空斑，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯增加，線粒體腫脹，線粒體嵴數(shù)量減少，基質(zhì)電子密度增高，α糖原顆粒明顯減少，即細(xì)胞脹亡樣改變。亦可

7、見細(xì)胞凋亡樣改變，即細(xì)胞漿萎縮、核固縮、染色質(zhì)凝聚成團(tuán)塊位于核邊緣呈“新月體”樣改變。GLN干預(yù)組肝細(xì)胞核核膜結(jié)構(gòu)模糊，常染色質(zhì)多，異染色質(zhì)少，線粒體數(shù)量較多，嵴豐富，基質(zhì)中等電子密度；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，許多糖原體附著于膜上。 3.肝組織NF-κB的表達(dá)：對照組肝細(xì)胞很少表達(dá)NF-κB，或僅少量表達(dá)于細(xì)胞漿內(nèi)；模型組致傷4h后NF-κB表達(dá)明顯增強(qiáng)，由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，16h后達(dá)到高峰(36.98±6.32％)；GLN干預(yù)組肝

8、細(xì)胞也有不同程度的陽性表達(dá)，但較模型組各時(shí)相平行比較均降低(P＜0.05)。 4.TNF-αmRNA的表達(dá)：正常對照組TNF-αmRNA表達(dá)痕量，模型組各時(shí)相點(diǎn)均有不同程度的表達(dá)，在致傷12h后出現(xiàn)高峰，隨后逐漸下降。GLN干預(yù)組各時(shí)相TNF-αmRNA的表達(dá)均較模型組降低(P＜0.05)。 5.細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果：對照組極少數(shù)細(xì)胞凋亡，模型組致傷后各時(shí)相均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡，TUNEL染色表現(xiàn)為細(xì)胞核染成棕褐色，核

9、固縮，染色質(zhì)邊集，胞質(zhì)嗜酸性，經(jīng)GLN干預(yù)后AI明顯降低(P＜0.05)。 6.細(xì)胞脹亡的檢測結(jié)果：透射電鏡下發(fā)現(xiàn)對照組未見細(xì)胞脹亡，模型組在致傷4h后即出現(xiàn)大量的細(xì)胞脹亡樣改變，表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大、腫脹，胞膜局部向外膨隆，胞膜完整性被破壞，胞質(zhì)空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，嵴腫脹，染色質(zhì)分散或凝集成塊，分布在核仁周圍或核膜下。細(xì)胞脹亡的出現(xiàn)早于細(xì)胞凋亡。GLN干預(yù)組各時(shí)相OI較模型組明顯降低(P＜0.05)。 由此得出以下結(jié)論：

10、 1.在GCL4誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷模型中，血清ALT、AST水平明顯增高，同時(shí)肝組織NF-κB及TNF-α的表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡和脹亡同時(shí)存在，細(xì)胞脹亡在肝損傷中的作用不可輕視； 2.GLN能夠降低CCL4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷中血清ALT、AST水平，保護(hù)保護(hù)肝細(xì)胞功能； 3.GLN可通過抑制NF-κB及TNF-α在組織的表達(dá)，從而減少肝細(xì)胞損傷； 4.GLN可減少肝細(xì)胞凋亡及脹亡的發(fā)生，保護(hù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功