去甲斑蝥素對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠的保護(hù)作用及活化肝星狀細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、肝損傷是多種肝臟疾病共有的一種病理變化結(jié)果,其長(zhǎng)期存在是導(dǎo)致肝纖維化,甚至肝硬化、肝癌發(fā)生的重要始動(dòng)因素。四氯化碳誘導(dǎo)肝損傷模型是經(jīng)典的肝損傷模型,其機(jī)制是氧化應(yīng)激在肝損傷中起著主導(dǎo)作用,造成肝細(xì)胞變性、壞死及炎癥反應(yīng)。在肝損傷和損傷修復(fù)過(guò)程中,靜止型肝星狀細(xì)胞激活轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞(MYB),具有產(chǎn)生大量ECM的特征,并且當(dāng)損傷刺激不能及時(shí)去除,多數(shù)向肝纖維化發(fā)展。因此,去除病因、減輕肝損傷、針對(duì)過(guò)量活化}tSC靶向治療等成為綜合防治

2、肝損傷的主要措施。去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)作為斑蝥素的衍生物不僅保留了抗腫瘤活性和提升白細(xì)胞的作用,并且明顯降低了毒副作用。已有報(bào)道NCTD可以保護(hù)肝功能,但是保肝機(jī)制均未詳細(xì)報(bào)道。并且還具有抗乙肝病毒作用。研究顯示NCTD能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,推測(cè)NCTD對(duì)活化HSC具有誘導(dǎo)凋亡作用。為此,本研究來(lái)研究去甲斑蝥素對(duì)四氯化碳肝損傷的保護(hù)保護(hù)作用及抗氧化應(yīng)激機(jī)制,同時(shí)探討其對(duì)大鼠活化HSC是否具有促凋亡作用,從

3、而為去甲斑蝥素臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的:本課題旨在研究觀察NCTD對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷保護(hù)作用及活化肝星狀細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法:
　　 ①實(shí)驗(yàn)大鼠被隨機(jī)分為正常對(duì)照組、肝損傷模型組(模型組)、雙環(huán)醇對(duì)照組(陽(yáng)性對(duì)照組)和去甲斑蝥素兩個(gè)劑量的治療組(10mg/kg,20mg/kg)。模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和治療組分別用四氯化碳造成大鼠急性實(shí)驗(yàn)性肝損傷,去甲斑蝥素組加用去甲斑蝥素片分兩個(gè)劑量(

4、10mg/kg/d,20mg/kg/d)于造模型當(dāng)天即開始灌胃2周。陽(yáng)性對(duì)照組用雙環(huán)醇120mg/kg/d灌胃,正常對(duì)照組和肝損傷模型組灌胃以相同劑量的蒸餾水2周。各組均于2周末留取標(biāo)本。經(jīng)組織石蠟切片}玎巳及Masson染色檢測(cè)模型建立及治療后的病理改變情況;利用病理圖像分析軟件來(lái)檢測(cè)肝組織Masson染色膠原面積密度:測(cè)定血清ALT、AST酶含量;測(cè)定肝組織SOD活性含量和MDA含量;免疫組化方法檢測(cè)肝組織中α-SMA的表達(dá)變化;T

5、UNEL和α-SMA免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色方法檢測(cè)HSC的凋亡。
　　 ②NCTD干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞,研究其對(duì)肝星狀細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)、Casepase3活性的變化及對(duì)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果:
　　 ①四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷模型組與正常組比較,模型組血清ALT、AST。酶含量升高,且模型組大鼠肝臟明顯腫脹,外觀呈

6、暗黃或土黃色。通過(guò)肝組織石蠟切片臟和Masson三色染色病理顯示肝脂肪變性明顯,炎細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生等。結(jié)果證明四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝損傷模型建立成功。雙環(huán)醇組和NCTD組治療后上述病理改變均減輕。
　　 ②NCTD對(duì)大鼠肝功能的影響:模型組血清ALT和AST’含量比正常對(duì)照組升高了559.78％和212.29％均有顯著差別(P＜0.01);雙環(huán)醇組和NCTD治療組(20 mg/kg)與模型組比較,均使ALT降低了35.19％

7、和27.19％,AST降低了42.45％和39.18％,統(tǒng)計(jì)均有意義(P＜0.05);雙環(huán)醇組和NCTD(20mg/kg)治療組沒有明顯差異(P＞0.05)。
　　 ③通過(guò)對(duì)膠原面積密度半定量分析,結(jié)果顯示模型組比正常對(duì)照組膠原含量明顯升高了317.3％(P＜0.01);雙環(huán)醇組和NCTD治療組均使得膠原含量降低,統(tǒng)計(jì)結(jié)果有意義(P＜0.05),但治療的三組間沒有統(tǒng)計(jì)差異(P＞0.05)。
　　 ④NCTD對(duì)大鼠肝組織氧

8、化應(yīng)激的影響:與正常組相比,模型組肝組織中SOD含量降低了75.5％和MDA含量升高405.64％,統(tǒng)計(jì)有明顯差別(P＜0.01);治療后,雙環(huán)醇對(duì)照組和治療組與模型組比較肝組織中SOD含量升高和MDA含量降低均有差別(P＜0.05);雙環(huán)醇和NCTD(20 mg/kg)治療效果相同,但二者沒有統(tǒng)計(jì)差異(P＞0.05)。
　　 ⑤用免疫組織化學(xué)檢測(cè)α-SMA在損傷大鼠肝臟的表達(dá)變化,結(jié)果模型組肝組織α-SMA的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯高

9、于正常對(duì)照組648.8％有顯著差別(P＜0.01),NCTD(10mg/kg、20mg/kg)治療組較模型組下降17.6％和39.25％,差別有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05),呈劑量依賴關(guān)系。
　　 ⑥TUNEL和α-SMA免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色方法檢測(cè)HSC的凋亡表明,治療組在凋亡數(shù)和凋亡率均高于模型組(P＜0.05),特別是高劑量(20 mg/kg)NCTD組表現(xiàn)明顯。
　　 ⑦JC-1試劑盒流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞的早期凋亡線

10、粒體膜電位改變結(jié)果示:5.0μg/ml去甲斑蝥素組分別作用于HSCs6h、12h、24h與陰性對(duì)照組相比線粒體膜電位均降低(0.891±0.057、0.591±0.010、0.714±0.016)較陰性對(duì)照組(1.872±0.019)相比,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 ⑧Caspase3活性檢測(cè)顯示:5.0μg/ml的去甲斑蝥素作用活化的肝星狀細(xì)胞6h、12h、24h、36h后,Caspase3活性(0.657±0.0