木蹄復(fù)方水提物對四氯化碳肝損傷的保護作用及其機制.pdf

1、研究目的:
　　 本課題采用體外、體內(nèi)化學(xué)性肝損傷模型進行藥效學(xué)試驗，觀察木蹄復(fù)方水提物(aqueous extract from Fomes Fomentarius compound，AEFFC)對四氯化碳(CCl4)所致肝損傷的保護作用，并初步探討其作用機理，同時觀察AEFFC對小鼠的急性毒性反應(yīng)，以初步評價其安全性，希望為AEFFC在肝損傷性疾病的防治提供實驗依據(jù)，推動其在臨床上更為廣泛的應(yīng)用。
　　 研究方法:<

2、br>　　 1、AEFFC對四氯化碳致L-02肝細胞損傷的保護作用
　　 (1) L-02體外肝損傷模型的建立:用不同濃度的CCl4作用L-02肝細胞，24 h后，MTT法檢測細胞活性，確定CCl4造模的最佳濃度;
　　 (2)細胞實驗分為六組:CCl4模型組（終濃度為20 mmol/L）、AEFFC(50、100、200μg/ml)+CCl43個處理組、空白對照組、維生素E(終濃度為50 mmol/L)+ CCl4組

3、，每組設(shè)8個復(fù)孔;
　　 (3)通過MTT法檢測細胞活性;
　　 (4)通過分光光度法測定細胞培養(yǎng)上清液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性;
　　 (5)測定細胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。
　　 2、AEFFC對小鼠CCl4急性肝損傷的保護作用
　　 (1)建立小鼠急性肝損傷模型:采用CCl4制備小鼠急性肝損傷模型，將小鼠隨機分為6組，分別為正常對照組、

4、模型組、不同濃度AEFFC組(100、200、400 mg/kg)和聯(lián)苯雙酯滴丸(BDP)陽性對照組(150 mg/kg)，每組10只。灌胃給藥，正常組及模型組給予蒸餾水，其它各組分別給予相應(yīng)劑量藥物，1d/次，連續(xù)7d。末次給藥后2h，模型組及各給藥組均腹腔注射0.1％ CCl4植物油溶液10 mL/kg，而正常組腹腔注射不含CCl4植物油10 mL/kg，制備小鼠急性肝損傷模型。禁食（不禁飲）18 h;
　　 (2)分離血清

5、，檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性變化以及TNF-α的含量;
　　 (3)取肝臟組織，HE染色作病理檢查;
　　 (4) TUNEL法檢測肝組織凋亡細胞比率;
　　 (5)檢測肝組織勻漿MDA、SOD的含量;
　　 (6)實時熒光定量PCR方法檢測TNF-α mRNA的表達。
　　 3、急性毒性試驗
　　 將40只小鼠隨機分成AEFFC組和空白對照組，每組20只。AEF

6、FC組小鼠用最大濃度0.48g/mL、最大體積0.25 mL/10g藥物，上下午各一次灌胃?？瞻讓φ战M灌胃等體積的蒸餾水。給藥后連續(xù)觀察14d，詳細記錄小鼠活動情況及死亡數(shù)量。實驗結(jié)束時，將動物全部處死，解剖，肉眼觀察其主要臟器組織病變情況，計算MTD。
　　 結(jié)果:
　　 1、AEFFC對四氯化碳致L-02肝細胞損傷的保護作用
　　 (1)建立了L-02體外肝損傷模型:隨著CCl4濃度的升高，L-02肝細胞存活

7、率逐漸下降，我們采用20 mmol/L CCl4作用24小時作為L-02肝細胞的損傷模型;
　　 (2)AEFFC明顯改善四氯化碳處理L-02肝細胞的形態(tài):細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，各AEFFC組細胞生長狀況明顯優(yōu)于四氯化碳處理模型組，且各劑量組隨著濃度的遞增，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，細胞皺縮的程度減輕，結(jié)構(gòu)逐漸清晰，脫落減少;
　　 (3) AEFFC對CCl4損傷L-02肝細胞培養(yǎng)上清液中轉(zhuǎn)氨酶具有顯著的降低作用:與正

8、常對照組相比，模型組轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，各AEFFC組的ALT、AST除50μg/mL的AST與模型對照組無顯著差異外(P＞0.05)，其余各劑量組的轉(zhuǎn)氨酶均明顯降低;
　　 (4) AEFFC顯著降低CCl4損傷L-02肝細胞MDA含量，提升SOD活性:CCL4損傷后模型組肝細胞超氧化物歧化酶(SOD)活性明顯降低，丙二醛(MDA)含量明顯升高，各AEFFC組的MDA、SOD除50μg/mL的MDA與模型對照組無顯著差異外，其余劑

9、量組都能顯著提高CCl4損傷后肝細胞中的SOD活力，降低CCl4損傷后肝細胞中的MDA水平;
　　 (5) AEFFC顯著提高CCl4損傷L-02肝細胞的存活率:CCl4損傷后模型組細胞活性明顯下降，僅為正常組的55.4％，各AEFFC組與模型組相比，細胞存活率均顯著升高。
　　 2、AEFFC對小鼠四氯化碳急性肝損傷的保護作用
　　 (1)AEFFC降低四氯化碳肝損傷小鼠的肝臟指數(shù):模型組肝臟指數(shù)為5.12±0

10、.41％，明顯高于正常對照組;不同濃度的AEFFC組及BDP組可降低肝臟指數(shù)。
　　 (2)AEFFC顯著降低四氯化碳損傷小鼠血清AST、ALT含量:正常對照組的ALT、AST與模型組相比，均存在非常顯著性差異(P＜0.01)，說明模型成立。各AEFFC組的ALT、AST與模型組相比，均顯著或非常顯著下降(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 (3) AEFFC顯著降低四氯化碳肝損傷小鼠血清TNF-α水平:與正常組比較，

11、模型組小鼠血清中TNF-α水平有非常顯著性差異(P＜0.01);AEFFC組能顯著或非常顯著抑制模型小鼠血清TNF-α水平的升高(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 (4) AEFFC顯著提高四氯化碳肝損傷小鼠肝組織SOD活性，降低MDA含量:模型組小鼠肝組織中SOD活力明顯低于正常對照組;AEFFC組和BDP組SOD活力均高于模型組。與SOD相反，模型組小鼠肝組織中MDA含量明顯高于正常對照組;AEFFC組和BDP組MDA含

12、量均低于模型組。
　　 (5) AEFFC對四氯化碳損傷小鼠肝臟病理組織學(xué)的影響:解剖顯示，正常組小鼠的肝臟表面光澤度好，觸感較軟，顏色暗紅;CCl4模型組小鼠肝臟觸感偏硬，顏色土灰，體積腫大;而各AEFFC組和BDP組小鼠肝臟外觀、色澤介于上述兩組之間。光鏡下觀察HE染色結(jié)果，正常組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝索排列規(guī)則，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，細胞形態(tài)正常。模型組肝小葉界限模糊，肝細胞索紊亂，肝細胞變性，細胞濁腫，空泡，點片狀壞死，嗜酸

13、性變和脂肪性變嚴重，炎性細胞浸潤明顯，有一些大片狀肝細胞壞死灶。各AEFFC組肝小葉結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)基本正常，肝細胞變性、壞死較輕，有輕微的炎細胞浸潤，按照標準評估損傷積分，提示AEFFC可顯著降低CCl4肝損傷程度。
　　 (6) AEFFC顯著降低四氯化碳肝損傷小鼠肝細胞的凋亡:TUNEL染色顯示，模型組呈現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)，而AEFFC組與BDP組凋亡征象及凋亡指數(shù)明顯降低。
　　 (7) AEFFC對肝損傷小鼠肝組織

14、TNF-α mRNA表達的影響:AEFFC對TNF-αmRNA的表達影響不顯著（差異量＜2倍）。
　　 3、急性毒性試驗
　　 小鼠的最大耐受量＞24 g/kg，說明AEFFC口服毒性低，安全性較大。
　　 結(jié)論:
　　 本課題以CCl4誘導(dǎo)的人正常肝細胞損傷體外模型及小鼠急性肝損傷體內(nèi)模型為基礎(chǔ)，從多個角度考察AEFFC對急性肝損傷的保護功能，初步探討了AEFFC治療急性肝損傷可能涉及的作用機制，提示A