新型免疫調節(jié)艾拉莫德對MRL-lpr小鼠類狼瘡樣疾病治療作用及對其B細胞分化功能影響的研究.pdf

1、背景和目的：
　　艾拉莫德是一種新型小分子免疫調節(jié)劑，現(xiàn)在的研究已證明此藥具有多種免疫調節(jié)功能，包括:能夠抑制滑膜細胞TNF-α及單核細胞NF-κB通路、增加單核細胞膜穩(wěn)定性、抑制大鼠關節(jié)CIA發(fā)生、下調IL-17、IL-1、IL-6、IFN-γ等多種炎癥因子、抑制IL-17通路等。在本課題組和國外研究者分別完成的RA臨床試驗中，艾拉莫德顯示出和MTX相當?shù)寞熜Ъ鞍踩浴?br>　　前期基礎和臨床研究均提示艾拉莫德對體液免疫可能存

2、在抑制作用。體外實驗發(fā)現(xiàn)艾拉莫德能夠抑制人和小鼠B細胞的免疫球蛋白產生、免疫重建實驗發(fā)現(xiàn)艾拉莫德可抑制RA患者滑膜組織免疫球蛋白的產生;臨床試驗也發(fā)現(xiàn)艾拉莫德組RA患者血清免疫球蛋白和類風濕因子水平出現(xiàn)下降。鑒于RA和SLE具有包括自身抗體在內的多種共同發(fā)病機制，我們推測艾拉莫德對SLE可能亦存在治療作用。
　　MRL/lpr小鼠是一種經典的自身抗體介導的類紅斑狼瘡疾病模型。它們由于MRL品系小鼠基因背景和淋巴細胞凋亡障礙的共同作

3、用而發(fā)病，在生命后期可出現(xiàn)免疫性腎炎、淋巴器官腫大、關節(jié)炎、皮損等多種改變，體內出現(xiàn)豐富自身抗體。小鼠外周淋巴細胞出現(xiàn)多重失衡:漿細胞增多，正常T、B細胞比例因B220+T細胞累積而降低，濾泡B細胞減少而邊緣區(qū)B細胞增多，未成熟B細胞增多，等等。為進一步驗證我們對艾拉莫德治療SLE的猜想，本研究選擇MRL/lpr小鼠，系統(tǒng)觀察了艾拉莫德對其的治療作用，并初步探討了這個藥物在此模型中可能的作用機理。
　　材料和方法：
　　選擇

4、雌性MRL/lpr小鼠，分別隨機給藥艾拉莫得、空白載體溶液作為安慰劑或環(huán)磷酰胺作為陽性對照。選擇不攜帶lpr基因的野生型雌性BALB/c小鼠為背景對照。
　　采用BCA法定期定量檢測小鼠尿蛋白濃度，放免法定期檢測血清抗dsDNA抗體的水平，ELISA法檢測血清補體C3及免疫球蛋白各亞型水平，血細胞分析儀及全自動生化儀定期檢測給藥小鼠的全血細胞計數(shù)及肝腎功能。小鼠腎臟標本進行H&E染色，由腎臟病理專家盲法讀片，半定量評估腎小球累及及

5、腎小血管累及情況。免疫組化對小鼠腎臟IgG及CD20染色。
　　分離小鼠脾臟淋巴細胞，流式檢測其中B細胞各亞群及漿細胞比例。脾臟淋巴細胞的BAFF、IL-6、IL-21、IL-17A表達水平采用實時定量熒光PCR檢測，血清BAFF水平采用ELISA法檢測。
　　小鼠脾細胞進行annexinⅤ/PI染色，流式鑒定其中凋亡細胞比例。采集健康人外周血總B細胞，體外F(ab')2 anti-IgM、IL-21、IL-4及CD40L聯(lián)

6、合刺激使其增殖，并進行BrdU及7-AAD染色，流式檢測細胞周期，體外觀察艾拉莫得對正常人B細胞增殖及凋亡的影響。
　　結果：
　　艾拉莫德可明顯緩解MRL/lpr小鼠類狼瘡樣疾病病情。小鼠經艾拉莫德治療后蛋白尿發(fā)生時間和水平均顯著低于安慰劑組，腎臟病理顯示免疫性腎炎病變輕于安慰劑組，盲法評定的腎小球損傷及血管周圍炎癥積分差異具有統(tǒng)計學差異。艾拉莫德組小鼠抗ds-DNA抗體水平顯著低于安慰劑組，低補體血癥、高免疫球蛋白血也同

7、時得到明顯緩解。免疫組化顯示艾拉莫德組小鼠腎臟IgG免疫復合物沉積顯著少于安慰劑組，半定量吸光度計算顯示兩組具有顯著統(tǒng)計學差異。以上結果同時證實了艾拉莫德對小鼠體液免疫的抑制作用。
　　我們進一步發(fā)現(xiàn)艾拉莫德對MRL/lpr小鼠外周淋巴細胞具有多種調節(jié)作用。外周異常B220+T細胞及漿細胞比例經艾拉莫德治療后下降，而外周總B細胞比例出現(xiàn)恢復，趨向于正常BALB/c小鼠水平;同時作為靶器官的腎組織中CD20+B細胞的浸潤在艾拉莫德治

8、療后顯著減少。艾拉莫德組小鼠脾臟漿細胞數(shù)量顯著少于安慰劑組，與血清免疫球蛋白檢測結果相呼應。小鼠脾臟內異常升高的生發(fā)中心、邊緣區(qū)B細胞和異常降低的濾泡B細胞亞群比例經過艾拉莫得治療后均得到部分糾正;艾拉莫德組脾臟內異常增多的未成熟過度型B細胞比例也顯著低于安慰劑組;而環(huán)磷酰胺上述效應并不明顯。MRL/lpr小鼠脾細胞及血清中促進B細胞活化的多種細胞因子，包括BAFF、IL-6、IL-21、IL-17A水平在艾拉莫德給藥后出現(xiàn)明顯下降，與