胎鼠及新生鼠外周血(FNPB)輸注對MRL-lpr小鼠作用的實驗研究.pdf

1、目的:在減低劑量放射線預處理方案下，觀察來源于C57BL/6孕鼠的FNPB對MRL/lpr小鼠的作用及其可能機制。
　　方法:
　　1.收集C57BL/6孕鼠FNPB細胞，密度梯度離心法分離FNPB中的MNC并計數MNC含量，然后輸注MNC至20周齡MRL/lpr小鼠。
　　2.觀察各組MRL/lpr小鼠GVHD表現(xiàn):包括小鼠體重、體位、活動能力、毛發(fā)變化及大小便情況。
　　3.分析各組MRL/lpr小鼠死亡率、

2、體重（20周齡、24周齡、28周齡和32周齡）和脾臟指數（32周齡）改變情況;采用ELISA法檢測各組MRL/lpr小鼠在20周齡、24周齡和32周齡時血清抗ds-DNA抗體、ANA濃度;采用ELISA法檢測各組MRL/lpr小鼠在32周齡時血清IL-17和TGF-β濃度;采用全自動生化分析儀檢測MRL/lpr小鼠在20周齡、24周齡和32周齡時血清肌酐濃度;采用考馬斯亮藍法檢測MRL/lpr小鼠在20周齡、24周齡、28周齡和32周齡

3、時24h尿蛋白;采用流式細胞儀分析各組MRL/lpr小鼠在32周齡時外周血Th1、Th2、Th17、Treg和CD8+T細胞。32周齡時處死MRL/lpr小鼠，進行MRL/lpr小鼠腎臟病理切片，H.E染色鏡檢分析;并采用原位雜交法檢測MRL/lpr小鼠腎內血管平滑肌細胞中的microRNA-145表達情況。
　　結果:
　　1.FNPB中MNC濃度為9.5×106/ml，細胞存活率97％以上。
　　2.在移植組中所有

4、小鼠均活潑地存活到32周齡直至被處死，無諸如脫毛、腹瀉、皮疹、出血、消瘦等明顯GVHD表現(xiàn);但放療組小鼠在接受放射線照射后第24天出現(xiàn)頭、頸、背部毛發(fā)開始變淺、變灰，至第55天，這些部位的毛發(fā)明顯變白。
　　3.對照組和放療組小鼠生存率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);移植組小鼠生存率較對照組、放療組小鼠明顯升高（P均＜0.05）。
　　4.(1)在32周齡時，放療組和移植組小鼠脾臟指數較對照組均明顯減小(P均＜0.05）;

5、放療組和移植組之間無明顯差異(P＞0.05)。
　　(2)在20周齡、24周齡時，三組小鼠在平均體重、血清抗ds-DNA抗體、ANA和血清肌酐無差異（P均＞0.05）;在28周齡時，三組MRL/lpr小鼠平均體重無差異（P均＞0.05）;在32周齡時，放療組和移植組小鼠平均體重均明顯高于對照組(P均＜0.05），但是移植組小鼠體重較放療組稍增加(P＞0.05);在32周齡時，放療組和移植組小鼠血清抗ds-DNA抗體和ANA均明顯低

6、于對照組(P均＜0.05），但是在放療組和移植組中血清抗ds-DNA抗體和ANA均無差異（P均＞0.05）;在32周齡時，移植組小鼠血清肌酐均明顯低于對照組和放療組(P均＜0.05);同時，放療組小鼠血清肌酐稍低于對照組(P＞0.05)。(3)在20周齡時，3組MRL/lpr小鼠24h尿蛋白無差異（P均＞0.05）。在24周齡和28周齡時，放療組和移植組小鼠24h尿蛋白明顯低于對照組(P均＜0.05）。32周齡時，對照組和放療組小鼠24

7、h尿蛋白無差異(P＞0.05);在移植組中，24h尿蛋白水平均明顯低于對照組和放療組(P均＜0.05）。(4)與放療組比較，移植組小鼠的白細胞從最低值上升至1.0×109/L的時間明顯縮短（P＜0.05）;并且，移植組小鼠血小板最低值高于放療組（P＜0.05），血小板下降至最低值的時間以及從最低值上升至100×109/L的時間均明顯低于放療組（P均＜0.05）;與放療組比較，移植組小鼠血紅蛋白從最低值上升至100g/L的時間明顯縮短（P

8、＜0.05）。(5)在32周齡時，與對照組比較，放療組和移植組小鼠中CD4+T細胞的百分率明顯降低、CD8+T細胞的百分率明顯增加、CD4+/CD8+比值明顯降低（P均＜0.05）。并且，與對照組比較，放療組和移植組中Th1細胞百分率明顯增加、Th2細胞百分率明顯降低、Th1/Th2比值明顯增高（P均＜0.05）。但是，與放療組比較，移植組中Th1細胞和CD8+T細胞稍增加、Th2細胞和CD4+T細胞稍下降（P均＞0.05）。(6)在3

9、2周齡時，與對照組比較，放療組和移植組Treg細胞均明顯增加、Th17細胞均明顯減少（P均＜0.05）;與對照組比較，放療組和移植組Treg/Th17比值明顯增加（P均＜0.05）。但是，在放療組和移植組中，Treg細胞、Th17細胞和Treg/Th17比值無差異(P均＞0.05)。(7)32周齡時，與對照組比較，放療組和移植組小鼠血清TGF-β的濃度明顯增加（P均＜0.05）;但是放療組和移植組間無差異(P＞0.05)。與對照組比較，

10、放療組和移植組小鼠血清IL-17濃度明顯減少（P均＜0.05）;但在放療組和移植組之間無差異(P＞0.05)。(8)在MRL/lpr小鼠中，其腎臟血管平滑肌細胞中存在microRNA-145的表達，但是在腎內血管的內膜和外膜中沒有發(fā)現(xiàn)明顯microRNA-145表達。(9)與對照組和放療組MRL/lpr小鼠相比， microRNA-145在移植組MRL/lpr小鼠腎臟血管平滑肌細胞中表達均明顯增加（P均＜0.05);與對照組MRL/lp

11、r小鼠相比，在放療組MRL/lpr小鼠腎臟血管平滑肌細胞中表達稍增加(P＞0.05)。(10)在對照組小鼠腎臟中可見腎小球系膜細胞與系膜基質均明顯增生，放療組和移植組小鼠均局灶輕度增生;在對照組小鼠腎小管明顯空泡變性并刷狀緣脫落;放療組小鼠部分毛細血管袢開放不良，部分腎小管空泡變性;在移植組小鼠腎臟中毛細血管袢開放良好，少許腎小管可見空泡變性。
　　結論:
　　1.FNPB輸注對MRL/lpr小鼠的治療能夠發(fā)揮極好的GVA效

12、應，同時FNPB治療MRL/lpr小鼠也是安全的，沒有造成明顯的GVHD表現(xiàn)。
　　2.FNPB輸注能夠較快促進經放射線預處理的MRL/lpr小鼠的造血系統(tǒng)恢復，并對MRL/lpr小鼠具有免疫調控作用。
　　3.microRNA-145在MRL/lpr小鼠腎臟血管平滑肌細胞中存在表達，并且FNPB治療能夠提高MRL/lpr小鼠腎內血管平滑肌細胞中microRNA-145的表達。
　　第一部分 FNPB輸注對MRL/lp

13、r小鼠的GVA和GVHD作用
　　目的:研究FNPB輸注對MRL/lpr小鼠的GVA和GVHD作用。
　　方法:(1)收集C57BL/6孕鼠FNPB細胞，密度梯度離心法分離FNPB中的MNC并計數MNC含量，然后輸注MNC至20周齡MRL/lpr小鼠。(2)觀察各組MRL/lpr小鼠GVHD表現(xiàn)。(3)分析各組MRL/lpr小鼠死亡率、體重(20周齡、24周齡、28周齡和32周齡)和脾臟指數（32周齡）改變情況;并采用ELI

14、SA法檢測各組MRL/lpr小鼠在20周齡、24周齡和32周齡時血清抗ds-DNA抗體、ANA濃度;采用全自動生化分析儀檢測MRL/lpr小鼠在20周齡、24周齡和32周齡時血清肌酐濃度;采用考馬斯亮藍法檢測MRL/lpr小鼠在20周齡、24周齡、28周齡和32周齡時24h尿蛋白。32周齡時處死MRL/lpr小鼠，進行MRL/lpr小鼠腎臟病理切片，H.E染色鏡檢分析。
　　結果:(1) FNPB中MNC濃度為9.5×106/ml

15、，細胞存活率97％以上。(2)在移植組中所有小鼠均活潑地存活到32周齡直至被處死，無諸如脫毛、腹瀉、皮疹、出血、消瘦等明顯GVHD表現(xiàn);但放療組小鼠在接受放射線照射后第24天出現(xiàn)頭、頸、背部毛發(fā)開始變淺、變灰，至第55天，這些部位的毛發(fā)明顯變白。(3)與對照組小鼠比較，放療組小鼠生存率輕微增高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;移植組小鼠生存率較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;移植組小鼠生存率較放療組增高，差異有統(tǒng)計

16、學意義(P＜0.05)。(4)在32周齡時，與對照組比較，放療組和移植組小鼠脾臟指數均明顯減小，差別有明顯統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）;放療組和移植組之間無明顯差異（P＞0.05）。(5)在20周齡、24周齡時，三組小鼠在平均體重、血清抗ds-DNA抗體、ANA和血清肌酐差別均無明顯統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）;在28周齡時，三組MRL/lpr小鼠平均體重無明顯統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）;在32周齡時，放療組和移植組小鼠平均體重均明顯

17、高于對照組（P均＜0.05），但是與放療組比較，移植組小鼠體重稍增加，差別無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05);在32周齡時，放療組和移植組小鼠血清抗ds-DNA抗體和ANA均明顯低于對照組，差別有明顯統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），但是在放療組和移植組中血清抗ds-DNA抗體和ANA均無明顯差異（P均＞0.05）;在32周齡時，移植組小鼠血清肌酐均明顯低于對照組和放療組，差別有明顯統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）;同時，放療組小鼠血清肌酐也低于

18、對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(6)在20周齡時，3組MRL/lpr小鼠24h尿蛋白差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。在24周齡和28周齡時，放療組和移植組小鼠24h尿蛋白明顯低于對照組，差別有明顯統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。32周齡時，對照組和放療組小鼠24h尿蛋白差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);在移植組中，24h尿蛋白水平均明顯低于對照組和放療組，差別有明顯統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。(7)在對照組小鼠腎臟中可

19、見腎小球系膜細胞與系膜基質均明顯增生，放療組和移植組小鼠均局灶輕度增生;在對照組小鼠腎小管明顯空泡變性并刷狀緣脫落;放療組小鼠部分毛細血管袢開放不良，部分腎小管空泡變性;在移植組小鼠腎臟中毛細血管袢開放良好，少許腎小管可見空泡變性。
　　結論:(1) FNPB輸注對MRL/lpr小鼠的治療能夠發(fā)揮極好的GVA效應，表現(xiàn)在提高MRL/lpr小鼠生存率，增加體重，減小脾臟指數，減少血清抗ds-DNA抗體、ANA和肌酐，減少24h尿蛋白

20、及改善腎臟病理損害。(2)FNPB治療MRL/lpr小鼠是安全的，沒有造成明顯的GVHD表現(xiàn)。
　　第二部分FNPB輸注對MRL/Ipr小鼠的造血恢復和免疫調控作用
　　目的:FNPB輸注對MRL/lpr小鼠的造血恢復和免疫調控作用。
　　方法:(1)收集C57BL/6孕鼠FNPB細胞，密度梯度離心法分離FNPB中的MNC，然后輸注MNC至放射線預處理的20周齡MRL/lpr小鼠。(2)血細胞計數儀檢測放療組和移植組M

21、RL/lpr小鼠在20W，21W，22W，23W，24W，28W，30W，32W外周血白細胞、血紅蛋白和血小板值。(3)采集三組MRL/lpr小鼠32周齡時外周血，采用流式細胞儀分析各組MRL/lpr小鼠Treg細胞;外周血刺激培養(yǎng)后，采用流式細胞儀分析各組MRL/lpr小鼠Th1、Th2、Th17和CD8+T細胞。(4)采集三組MRL/lpr小鼠32周齡時外周血，采用ELISA檢測法檢測小鼠血清TGF-β和IL-17濃度。
　　

22、結果:(1)與放療組比較，移植組小鼠的白細胞從最低值上升至1.0×109/L的時間明顯縮短，差別有明顯統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;并且，移植組小鼠血小板最低值高于放療組（P＜0.05），血小板下降至最低值的時間以及從最低值上升至100×109/L的時間均明顯低于放療組（P均＜0.05）;與放療組比較，移植組小鼠血紅蛋白從最低值上升至100g/L的時間明顯短于放療組，差別有明顯統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(2)在32周齡時，與對照組比較，

23、放療組和移植組小鼠中CD4+T細胞的百分率明顯降低，CD8+T細胞的百分率明顯增加，CD4+/CD8+比值較對照組明顯降低，差別有明顯統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。并且，與對照組比較，放療組和移植組中Th1細胞百分率明顯增加，而Th2細胞百分率明顯降低，Th1/Th2比值較對照組明顯增高，差別有明顯統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。但是，與放療組比較，移植組中Th1細胞和CD8+T細胞增加，Th2細胞和CD4+T細胞下降，但均無明顯統(tǒng)計學差

24、異（P均＞0.05）。(3)在32周齡時，與對照組比較，放療組和移植組Treg細胞均明顯增加（P均＜0.05），并且Th17細胞均明顯減少（P均＜0.05）;與對照組比較，放療組和移植組Treg/Th17比值明顯增加（P均＜0.05）。但是，在放療組和移植組中，Treg細胞、Th17細胞和Treg/Th17比值均無明顯統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）。(4)32周齡時，與對照組比較，放療組和移植組小鼠血清TGF-β的濃度明顯增加，差別有明顯

25、統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）;但是放療組和移植組間無明顯差異（P＞0.05）。與對照組比較，放療組和移植組小鼠血清IL-17濃度明顯減少，差別有明顯統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）;但在放療組和移植組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結論:(1) FNPB輸注能夠促進經放射線預處理的MRL/lpr小鼠的造血系統(tǒng)恢復，對白細胞、血紅蛋白和血小板都存在造血重建作用。(2) FNPB輸注對MRL/lpr小鼠具有免疫調控作用，能夠改

26、善Th1/Th2和Th17/Treg細胞平衡并對細胞因子也有明顯的調節(jié)作用。
　　第三部分FNPB治療對MRL/lpr小鼠腎內血管平滑肌細胞microRNA-145的作用
　　目的:研究FNPB治療對MRL/lpr小鼠腎內血管平滑肌細胞中microRNA-145的作用。
　　方法:(1)收集FNPB細胞，密度梯度離心法分離FNPB中的MNC，輸注MNC至20周齡MRL/lpr小鼠。(2)32周齡時處死MRL/lpr小鼠

27、，進行MRL/lpr小鼠腎臟病理切片。(3)原位雜交法檢測MRL/lpr小鼠腎內血管平滑肌細胞中的microRNA-145表達。
　　結果:(1)在MRL/lpr小鼠中，其腎臟血管平滑肌細胞中存在microRNA-145的表達，但是在腎內血管的內膜和外膜中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的microRNA-145的表達。
　　(2)與對照組和放療組MRL/lpr小鼠相比，microRNA-145在移植組MRL/lpr小鼠腎臟血管平滑肌細胞中表達