含小鼠FcγRⅡb基因慢病毒載體對MRL-lpr SLE小鼠的作用研究.pdf

1、目的：包裝含小鼠FcγRⅡB慢病毒表達載體，觀察其在小鼠B細胞表面的表達并研究其抑制性受體對MRL/lpr SLE小鼠的作用研究。
　　方法：將慢病毒表達重組質(zhì)粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒調(diào)節(jié)質(zhì)粒Tet分別與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉染 HEK293T細胞，分別包裝表達病毒和調(diào)節(jié)病毒，分別測定表達病毒和調(diào)節(jié)病毒感染滴度。將MRL/lpr SLE小鼠預防動物（周齡8周左右）40只隨機分成病毒液100ul組、病毒液200ul組、預防空病毒組

2、（不含F(xiàn)cγRIIb基因）、預防對照組（生理鹽水組）四組，每組10只，再將模型動物（周齡16周左右）組40只隨機分成病毒100ul組、200ul組、治療空病毒組（不含 FcγRIIb基因）和治療對照組（生理鹽水組），每組10只。通過尾靜脈注射將病毒液轉導到MRL/lpr SLE小鼠體內(nèi)，連續(xù)注射四周，每周一次。注射完成后，觀察二周后提尾反射法收集小鼠尿液檢測小鼠尿蛋白，眼眶內(nèi)眥靜脈取血約500μL后檢測小鼠抗核抗體和抗雙鏈DNA含量，取

3、血完成后處死小鼠，取各組小鼠新鮮脾臟組織進行研磨、淋巴細胞分離后再磁珠分選檢測B細胞上FcγRIIb基因的mRNA和蛋白的表達并做腎臟、淋巴結、肝臟的病理切片。同時各組的蛋白采用Western blot法和磷酸化Western blot，觀察B細胞通路上的Btk、Ship1、Pyn總蛋白和磷酸化蛋白的表達來研究其可能的機制。數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學處理，組間比較采用t檢驗分析，p<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。圖表利用Gra

4、phPad Prism5.0軟件繪制。
　　結果：
　　1．表達病毒和調(diào)節(jié)病毒滴度均達106TU/mL。
　　2．MRL/lpr SLEFcγRⅡB mRNA和蛋白表達水平檢測結果：預防和治療空病毒組與對照組相比無意義，病毒組（含100μL和200μL組）與空病毒組相比FcγRⅡB mRNA和蛋白增加。
　　3.MRL/lpr SLE小鼠尿蛋白、抗雙鏈DNA抗體含量檢測結果：預防和治療空病毒組與對照組相比無意義，

5、病毒組（含100μL和200μL組）與空病毒組相比尿蛋白、抗雙鏈DNA含量減少。
　　4.1、對照組B細胞上的Btk、Lyn與空病毒組相比無意義，預防病毒組中的Btk（含100μL和200μL組）與空病毒組相比蛋白含量明顯減少，p<0.01，有統(tǒng)計學意義。預防200μL組Btk總蛋白與100μL組相比明顯下降；治療組B細胞上的Btk各組蛋白無變化。預防病毒組中的 Lyn100μL與空病毒組相比蛋白含量明顯增加，p<0.01，有統(tǒng)計

6、學意義；200μL組與100μL組相比明顯下降；治療病毒組中的Lyn100μL組與200μL組相比明顯下降。Ship1總蛋白預防和治療各組無變化。
　　4.2、預防空病毒組Btk磷酸化、Lyn磷酸化和Ship1磷酸化水平與對照組比較沒有變化。預防病毒200μL組磷酸化Btk、磷酸化Lyn和磷酸化Ship1與空病毒組相比表達水平明顯減少，p<0.01，預防病毒100μL組與空病毒組相比無意義。預防病毒200μL組與100μL組相比明

7、顯下降。治療空病毒組Btk磷酸化、Lyn磷酸化和Ship1磷酸化水平與對照組比較沒有變化。治療病毒200μL組磷酸化Btk和磷酸化Ship1與空病毒組相比明顯增加，p<0.01，有統(tǒng)計學意義。治療病毒100μL組磷酸化Lyn與空病毒組相比蛋白含量明顯增加，p<0.01，有統(tǒng)計學意義。治療病毒200μL組與100μL組相比明顯升高。
　　5．病理結果：
　　A：腎臟：HE染色顯示，預防組小鼠腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)內(nèi)廣泛性血管充血擴張，

8、周圍淋巴細胞浸潤；病變腎小球內(nèi)可見細胞數(shù)量增多，體積輕微增大或正常，部分腎小球周圍有淋巴細胞浸潤。
　　治療組腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)內(nèi)廣泛性血管充血擴張，尤其髓質(zhì)區(qū)和腎小球毛細血管較明顯，葉間動脈以及弓形動脈擴張，官腔不整，周圍大量淋巴細胞浸潤；髓質(zhì)區(qū)彌漫性腎小球輕度增生性改變，病變腎小球內(nèi)可見細胞數(shù)量增多，體積輕微；小球周圍多量淋巴細胞浸潤，腎小球毛細血管團萎縮，硬化。病毒預防組和治療組（100μL和200μL）較各自對照組淋巴細胞浸潤

9、、彌漫性腎小球增生性改變較輕。
　　B：肝臟：預防組小鼠肝細胞廣泛性胞漿疏松化，中央靜脈周圍多量淋巴細胞浸潤，部分區(qū)域中央靜脈和肝血竇擴張；部分區(qū)域匯管區(qū)纖維組織增生，小血管擴張并大量淋巴細胞浸潤。
　　治療組小鼠肝細胞廣泛性胞漿疏松化，中央靜脈周圍大量淋巴細胞浸潤并分割肝小葉，部分區(qū)域中央靜脈和肝血竇擴張，小血管擴張并大量淋巴細胞浸潤，部分區(qū)域病變嚴重，肝小葉內(nèi)大量淋巴細胞浸潤并分割肝小葉，可見肝細胞點狀壞死，肝小葉幾乎被

10、淋巴細胞取代，小葉結構破壞。病毒預防組和治療組（100μL和200μL）較各自對照組淋巴細胞浸潤較輕。
　　C：淋巴結：預防組小鼠淋巴結輕度增殖性改變，淋巴結固有結構清晰，淋巴濾泡內(nèi)多量淋巴細胞，偶見生發(fā)中心；模型小鼠淋巴結以增殖性改變?yōu)橹?，主要表現(xiàn)為淋巴小結體積增大，淋巴濾泡增生，大量淋巴細胞增生，部分區(qū)域可見多量組織細胞增生，幾乎未見生發(fā)中心，以至于皮質(zhì)髓質(zhì)分界不清，嚴重病變可見淋巴結固有結構消失。病毒預防組（100μL和20