淫羊藿素對系統(tǒng)性紅斑狼瘡Foxp3-Il17a調(diào)控作用與分子機制及其治療MRL-lpr狼瘡鼠的實驗研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種多器官、多系統(tǒng)受累的自身免疫性疾病。其確切病因及發(fā)病機理尚不十分清楚，研究表明，CD4+T細胞在SLE自身免疫反應的啟動、維持以及器官損害方面發(fā)揮重要作用。調(diào)節(jié)性T(Treg)細胞和Th17細胞作為特殊的T細胞亞群，其平衡對維持免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定意義重大。大量實驗證明，Treg細胞和Th17細胞失衡與自身免疫性疾病特別是SLE的發(fā)生發(fā)展密切相關[1]。<

2、br>　　SLE的治療目前尚無有效根治辦法。盡管恰當?shù)膽每汞懰?、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑，以及生物制劑可使大多數(shù)患者達到病情緩解，但是部分患者對這些藥物不敏感、部分患者容易復發(fā)，部分患者對這些藥物的副作用難以耐受。因此，積極探尋新的治療方法、治療藥物刻不容緩。
　　淫羊藿為傳統(tǒng)中草藥，來源于小檗科淫羊藿屬植物。淫羊藿素(icaritin，ICT)是淫羊藿的主要成分淫羊藿苷的體內(nèi)代謝產(chǎn)物。在傳統(tǒng)醫(yī)學中淫羊藿是一種補腎壯陽的中藥，而現(xiàn)

3、代藥理研究表明，淫羊藿有效成分及其提取物具有廣泛的生理活性[2]。Zhang等在研究ICT抑制K562細胞株細胞增殖的過程中發(fā)現(xiàn)ICT具有下調(diào)雌激素受體活性[3]。Li等發(fā)現(xiàn)ICT能夠抑制T細胞活化從而延長老鼠接受皮膚同種異體移植后的壽命[4]。雌激素受體以及T細胞異常活化在SLE的發(fā)病過程中起了重要作用[5]。但是ICT對SLE的治療作用，國內(nèi)外尚無相關報道。在此背景下，我們進行了體外用ICT作用于SLE CD4+T細胞以及體內(nèi)治療M

4、RL/lpr狼瘡鼠的探索。通過體外實驗發(fā)現(xiàn)ICT能夠調(diào)控SLE CD4+T細胞Foxp3/IL17a平衡，增強Treg細胞抑制功能與抑制CD4+T細胞過度活化;進一步通過表達譜芯片與siRNA干擾實驗證實，ICT引起的轉錄因子STAT5b表達水平升高繼而影響Foxp3/IL17a啟動子區(qū)組蛋白修飾的改變可能是ICT調(diào)控Foxp3/IL17a平衡的機制之一;體內(nèi)給MRL/lpr狼瘡鼠喂養(yǎng)ICT，結果發(fā)現(xiàn)ICT能夠降低MRL/lpr狼瘡鼠尿

5、蛋白水平，減少腎臟組織IgG、C3沉積及改善腎臟組織病理損傷。
　　第一部分 ICT對SLE CD4+T細胞Foxp3/IL17a的調(diào)控作用
　　第一節(jié) ICT調(diào)控SLE CD4+T細胞Foxp3與IL17a表達
　　目的:
　　探討ICT對SLE CD4+T細胞Foxp3與IL17a表達水平的影響。
　　方法:
　　免疫磁珠法分離SLE患者外周血CD4+T細胞，用40uM/L ICT刺激CD4+T細

6、胞72h后，采用Real-time RT-PCR法檢測Foxp3與IL17a mRNA的表達水平，western blot檢測Foxp3蛋白水平，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測IL17a蛋白水平。
　　結果:
　　1.與對照組相比，ICT組Foxp3 mRNA水平顯著升高（對照組vsICT處理組:1±0.0 vs2.288±0.3962，P=0.0019）， IL17amRNA水平顯著下降(對照組vs ICT處理組:1±0

7、.0 vs0.4077±0.1839，P=0.002)。2.與對照組相比，ICT組Foxp3蛋白水平顯著升高（對照組 vs ICT處理組:0.6167±0.07638 vs1.46±0.2254，p=0.0036），IL17a蛋白水平下降(對照組 vs ICT處理組:41.86±12.82 vs30.34±0.7566，P=0.0344)。
　　結論:
　　ICT能夠增強SLE患者外周血CD4+T細胞Foxp3表達，降低IL

8、17a分泌。
　　關鍵詞:淫羊藿素;Foxp3;IL17a;基因表達
　　第二節(jié) ICT對SLE Treg細胞功能與CD4+T細胞自身免疫反應的影響
　　目的:
　　探討ICT對SLE Treg細胞抑制功能與CD4+T細胞自身免疫反應的影響。
　　方法:
　　免疫磁珠法分離SLE患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg細胞，CD4+CD25-T細胞，CD4+T細胞，CD19+B細胞。使用40u

9、M/L ICT刺激CD4+CD25+CD127-Treg細胞72h后，Treg細胞與CD4+CD25-T細胞1∶1共培養(yǎng)5天，采用淋巴細胞增殖試驗檢測Treg抑制功能，ELISA法檢測上清中細胞因子IL10，TGF-β水平。用40uM/L ICT刺激CD4+T細胞72h后，CD4+T細胞與自身CD19+B細胞1∶4共培養(yǎng)8天，收集細胞與上清，ELISA法檢測上清中IFN-γ，IL-6，TNF-α水平以及自身B細胞IgG抗體產(chǎn)量，流式細胞

10、術檢測CD4+T細胞表面自身免疫分子CD40L，CD70表達水平。
　　結果:
　　1.與對照組相比，ICT組Treg細胞抑制功能增強（對照組vs ICT處理組:33.67±10.97 vs63.1±2.265，p=0.0104），差異具有統(tǒng)計學意義。對照組和ICT組Treg細胞體外擴增2周后，細胞數(shù)量無明顯差異。
　　2.與對照組相比，ICT組IL-10分泌增加（78.19±35.01 vs196.2±38.21，p

11、=0.0039），差異具有統(tǒng)計學意義。TGF-β分泌物無顯著差異（110.2±3.942 vs114.4±5.568，p=0.1626）。
　　3.與對照組相比，ICT組刺激自身B細胞IgG抗體產(chǎn)量顯著下降（對照組vs ICT處理組:43.14±12.52 vs6.476±3.364，p=0.0013），差異具有統(tǒng)計學意義。
　　4.與對照組相比，ICT處理組CD4+T細胞分泌IFN-γ，IL-6，TNF-α水平降低（對照組

12、vs ICT處理組:330.6±17.23 vs194.56±6.762，P=0.0252;521.6±61.2 vs251.1±58.9, P=0.0337;750.2±32.753 vs420.6±23.341，p=0.0045），差異具有統(tǒng)計學意義。
　　5.與對照組相比， ICT組CD4+T細胞表面CD40L，CD70表達降低（對照組vs ICT處理組:2±0.1 vs1±0.2，P=0.029;對照組vsICT處理組:3

13、.6±0.26 vs1.46±0.25，P=0.00378）差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　ICT能夠增強Treg抑制功能，抑制CD4+T細胞過度活化及炎性因子的產(chǎn)生。
　　關鍵詞:淫羊藿素;調(diào)節(jié)性T細胞;CD4+T細胞;細胞因子
　　第二部分 ICT調(diào)控SLE CD4+T細胞Foxp3與IL17a表達的分子機制
　　第一節(jié) ICT對Foxp3與IL17a啟動子區(qū)組蛋白修飾的影響
　　目的:

14、r>　　探討淫羊藿對Foxp3與IL17a啟動子區(qū)組蛋白修飾的影響。
　　方法:
　　采用第一部分第一節(jié)預留的標本，染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)方法結合實時定量PCR(real-time PCR)法檢測Foxp3與IL17a啟動子區(qū)域H3K4、H3K9三甲基化、H4乙?；?。
　　結果:
　　與對照組相比，ICT組SLE患者CD4+T細胞Foxp3啟動子區(qū)H3K4me3的水平顯著升高(對照組vs ICT處理組:1

15、±0.0 vs11.1±3.21，P=0.0081);與對照組相比，ICT組SLE患者CD4+T細胞IL17a啟動子區(qū)H3K9me3的水平顯著升高（對照組vs ICT處理組:1±0.0vs4.367±1.106，p=0.0341）。對照組和ICT組Foxp3/IL17a啟動子區(qū)H4乙?；綗o明顯差異。
　　結論:
　　ICT通過增強H3K4me3的水平促進Foxp3表達，通過增強H3K9me3的水平降低IL17a表達。

16、r>　　關鍵詞:淫羊藿素;H3K4me3;H3K9me3;組蛋白修飾
　　第二節(jié) ICT刺激后SLE CD4+T細胞全基因組表達譜分析
　　目的:
　　通過表達譜芯片了解ICT刺激SLE CD4+T細胞后基因組表達水平的影響，并尋找ICT調(diào)控SLE CD4+T細胞Foxp3與IL17a表達的潛在靶點。
　　方法:
　　免疫磁珠法分離2例SLE患者外周血CD4+T細胞，使用40uM/LICT刺激CD4+T細胞

17、72h后，收集細胞、抽提總RNA，Affymetrix表達譜芯片檢測全基因組基因表達差異。采用GO分析以及Pathway分析找到富集差異的GO分類條目與Pathway條目;采用Real-timeRT-PCR法驗證挑選出的差異基因。
　　結果:
　　與對照組相比，ICT組共檢出3倍以上差異基因1007個，其中上調(diào)612個（占差異基因60％），下調(diào)395個（占差異基因40％）。GO分析以及Pathway分析發(fā)現(xiàn)ICT主要影響免疫

18、反應相關生物過程與信號通路的改變。挑選出的4個差異基因(IRF-4，STAT5a，STAT5b，HIF-1)是能夠共同調(diào)控Foxp3/IL17a表達的轉錄因子，Real-time RT-PCR驗證結果顯示這4個基因的表達趨勢與基因芯片檢測結果一致，其中STAT5b顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(1±0 vs2.467±0.1508, p=0.0339)。
　　結論:
　　ICT主要下調(diào)SLE CD4+T細胞免疫相關生物過程與信

19、號通路的基因表達，其中STAT5b可能是ICT調(diào)控Foxp3/IL17a的潛在靶點。
　　第三節(jié) ICT刺激后STAT5b的改變及其與Foxp3/IL17a的關系
　　目的:
　　探討干擾STAT5b后，淫羊藿對Foxp3/IL17a表達的調(diào)控是否改變。
　　方法:
　　設計針對STAT5的小干擾RNA，電穿孔法瞬時轉染活動性SLE患者的CD4+T細胞，再予ICT刺激24h。收集細胞后，用Real-time

20、RT-PCR及Western Blot檢測STAT5b干擾效果，用Real-time RT-PCR檢測Foxp3與IL17a mRNA水平。
　　結果:
　　干擾STAT5b后，ICT組較對照組Foxp3改變無統(tǒng)計學差異（1±0 vs1.073±0.07959，p=0.17），IL17a升高，但無統(tǒng)計學差異(1±0vs1.293±0.01839, p=0.18)。
　　結論:
　　干擾STAT5b后，ICT不能調(diào)

21、控Foxp3/IL17a表達。
　　關鍵詞:淫羊藿素;STAT5b;電穿孔;轉染
　　第三部分 ICT對MRL/Ipr狼瘡鼠的治療作用
　　目的:
　　探索ICT對MRL/lpr狼瘡鼠的治療作用。
　　方法:
　　SPF級別14周齡雌性MRL/lpr狼瘡鼠20只，隨機分成2組，其中實驗組10只，對照組10只。實驗組每天喂養(yǎng)ICT（用羧甲基纖維素制成糊狀），對照組每天喂養(yǎng)等量溶劑羧甲基纖維素(CMC)。

22、ELISA法檢測抗dsDNA抗體，IL-10，TGF-β，IFN-γ水平，尿蛋白試紙檢測尿蛋白水平，直接免疫熒光法檢測腎臟組織IgG，C3沉積，HE染色檢測小鼠腎臟損害情況。
　　結果:
　　1.對照組與ICT喂養(yǎng)組MRL/lpr狼瘡鼠抗dsDNA抗體、IL-10，TGF-β，IFN-γ水平比較
　　喂養(yǎng)4周后，即小鼠20周齡時，ELISA結果顯示，與對照組相比， ICT喂養(yǎng)組抗dsDNA抗體分泌降低(67140±48

23、36 vs55080±9596，p=0.0371)，差異具有統(tǒng)計學意義;IL-10分泌降低（6441±479.9vs5627±486.6，p=0.0116），差異具有統(tǒng)計學意義;TGF-β分泌無明顯改變（110.2±3.942 vs114.4±5.568，p=0.1626）;IFN-γ分泌無明顯改變（493.9±25.94 vs497±41.58，p=0.8675）。
　　2.對照組與ICT喂養(yǎng)組MRL/lpr狼瘡鼠尿蛋白比較

24、r>　　經(jīng)過4周ICT治療后，與對照組相比，ICT喂養(yǎng)組尿蛋白顯著降低（300±73.02967 vs84.2857±38.72105，P=0.0198），差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3.對照組與ICT喂養(yǎng)組MRL/lpr狼瘡鼠腎臟組織免疫熒光IgG，C3沉積
　　IgG，C3直接免疫熒光結果顯示:ICT喂養(yǎng)組狼瘡鼠腎小球系膜區(qū)著色亮度不清晰，熒光強度較弱，IgG，C3沉積較少;而對照組狼瘡鼠腎小球系膜區(qū)腎臟著色明顯，亮度耀眼

25、，IgG，C3沉積較多。
　　4.對照組與ICT喂養(yǎng)組MRL/lpr狼瘡鼠腎臟病理評分
　　HE染色結果顯示，與對照組相比，ICT喂養(yǎng)組腎臟病理腎小球評分降低（8.36±1.067 vs6.72±0.7935，p=0.0129），差異具有統(tǒng)計學意義;腎臟病理腎小管評分降低(8.16±1.328 vs6.04±1.054，p=0.012)，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　ICT對MRL/lpr狼瘡鼠腎臟損害有