A20治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型機(jī)制研究.pdf

1、SLE（systemic lupus erythematosus，系統(tǒng)性紅斑狼瘡）是一種自身免疫性炎癥性疾病，可累及腎、血管、皮膚、關(guān)節(jié)和腦等全身多個(gè)器官。在SLE進(jìn)展過(guò)程中，對(duì)核酸及其相互作用蛋白的免疫耐受缺失導(dǎo)致自身抗體產(chǎn)生最終引起全身炎癥和組織損傷。盡管在控制感染和腎衰的醫(yī)療進(jìn)展提高了紅斑狼瘡患者的生存時(shí)間，但目前仍缺乏有效的治療手段阻止SLE自身免疫炎癥的發(fā)生。傳統(tǒng)的免疫抑制劑缺乏靶向免疫抑制作用，療效不能保證，且副作用較多限制

2、其應(yīng)用。一些生物制劑在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病包括關(guān)節(jié)病型銀屑病等應(yīng)用獲得成功，但應(yīng)用于SLE并沒(méi)有獲得肯定的療效。因此發(fā)展新的治療藥物控制SLE自身炎癥的發(fā)生有著重要的意義。
　　A20又稱(chēng)為T(mén)NFAIP3(tumor necrosis factor alpha induced protein3，腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3)，是腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的鋅指蛋白。全基因組關(guān)聯(lián)研究證實(shí)TNFAIP3(A20)是SLE的易感基因，A20異常表

3、達(dá)與SLE的發(fā)病有著密切關(guān)系。之前的研究發(fā)現(xiàn)TNF-α刺激后紅斑狼瘡患者單核細(xì)胞異常低水平表達(dá)的A20導(dǎo)致NF-κB持續(xù)活化的炎癥反應(yīng)。因此我們推測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者炎癥活化階段A20表達(dá)相對(duì)不足導(dǎo)致NF-κB持續(xù)活化引起全身炎癥反應(yīng)可能是SLE發(fā)病機(jī)制之一，而通過(guò)藥物干預(yù)手段提高A20的表達(dá)水平就可能成為治療紅斑狼瘡的新策略。
　　瑞香素(Daphnetin)是瑞香科屬植物的自然提取物屬于香豆素類(lèi)化合物，它能顯著提高小鼠體內(nèi)A2

4、0的表達(dá)，且對(duì)自身免疫性關(guān)節(jié)炎發(fā)揮抗炎治療作用。目前以重組腺病毒為載體在動(dòng)物體內(nèi)過(guò)表達(dá)目的基因的研究方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和基因治療中。本研究利用瑞香素干預(yù)和重組腺病毒兩種方法在系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型中高表達(dá)A20蛋白，觀察在系統(tǒng)性狼瘡小鼠模型體內(nèi)提高A20的表達(dá)是否能緩解SLE炎癥反應(yīng)以及深入探討A20對(duì)SLE炎癥的治療機(jī)制，從而加深對(duì)SLE發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為SLE的治療提供新的治療策略。
　　研究一 瑞香素誘導(dǎo)A20高表

5、達(dá)抑制NZB/W F1小鼠炎癥反應(yīng)
　　目的:
　　研究瑞香素誘導(dǎo)的高表達(dá)A20是否對(duì)NZB/W F1狼瘡模型小鼠的炎癥有潛在的治療效應(yīng)。
　　方法:
　　16-18周NZB/WF1和BABL/c隨機(jī)分為三組:NZB/W F1小鼠未治療組(SLE;n=20)、NZB/W F1小鼠瑞香素治療組(Daphnetin;n=20)、BABL/c陰性對(duì)照組(Sham; n=10)。利用試劑盒檢測(cè)血尿素氮水平評(píng)估小鼠腎臟功能

6、;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清anti-nRNP IgG、anti-dsDNA IgG、TNF-α和IL-6;蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)外周血單核細(xì)胞pNFκB-p65和A20蛋白表達(dá)水平;曼-惠特尼u檢驗(yàn)或單因素方差分析統(tǒng)計(jì)組間差異，結(jié)果表示為(x)±s。
　　結(jié)果:
　　瑞香素治療后A20表達(dá)比未治療組顯著升高，SLE組小鼠A20表達(dá)比陰性對(duì)照組小鼠高;SLE模型小鼠血清TNF-α和IL-6比正常小鼠顯著升高，瑞香素治療后血清TNF-

7、α和IL-6水平明顯降低;SLE組小鼠血清anti-nRNP IgG和anti-dsDNA IgG高于陰性對(duì)照組小組，瑞香素治療組小鼠血清anti-nRNP IgG和anti-dsDNA IgG低于SLE組小鼠;瑞香素治療后小鼠尿素氮水平降低表明腎臟損傷減輕;SLE組pNFκB-p65蛋白表達(dá)比對(duì)照組提高，而瑞香素治療后pNFκB-p65蛋白表達(dá)顯著下降。
　　結(jié)論:
　　瑞香素誘導(dǎo)的高表達(dá)A20對(duì)NZB/W F1狼瘡模型小

8、鼠的炎癥有治療效果，高表達(dá)的A20使NF-κB活性下調(diào)可能其治療機(jī)制。
　　研究二 腺病毒介導(dǎo)A20過(guò)表達(dá)緩解pristane誘導(dǎo)的狼瘡腎炎
　　目的:
　　研究腺病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)A20是否對(duì)pristane誘導(dǎo)的狼瘡模型小鼠腎炎癥有治療效應(yīng)。
　　方法:
　　6-8周齡BALB/c雌性小鼠腹腔內(nèi)注射0.5mL pristine或者PBS，注射PBS的小鼠則成為正常對(duì)照組，3個(gè)月后注射pristane的小鼠

9、隨機(jī)分為Ad-A20、Ad-control和pristane組并在腹腔內(nèi)分別注射1.0×109pfu Ad-A20、Ad-control和PBS;利用ELISA試劑盒檢測(cè)血清IL-1β、IL-6 IgG、anti-nRNP、 anti-dsDNA和尿白蛋白;腎臟石蠟切片進(jìn)行H&E染色并在光鏡下觀察，以雙盲的方式對(duì)每只小鼠8個(gè)視野腎小球和腎小管評(píng)分進(jìn)行腎臟病理評(píng)估;腎臟冰凍切片進(jìn)行IgG和C3免疫熒光染色并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，熒光強(qiáng)度

10、利用Image J軟件評(píng)估并評(píng)分;蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)A20、NLRP3、ASC、p-IκB、IκB、F4/80、CCL2、Caspase-1p20、p-NF-κBp65和 NF-κBp65蛋白表達(dá)水平;曼-惠特尼u檢驗(yàn)或單因素方差分析統(tǒng)計(jì)組間差異，結(jié)果表示為x±s。
　　結(jié)果:
　　Pristane組和Ad-control組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞A20蛋白較PBS組小鼠比較而言表達(dá)輕度上調(diào)，而Ad-A20治療組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞A20

11、蛋白較其他三組比較而言顯著上調(diào);Pristane組和Ad-control組小鼠血清抗dsDNA和抗nRNP抗體水平顯著高于PBS組小鼠，而Ad-A20治療組小鼠血清抗dsDNA和抗nRNP抗體水平則較Ad-control組顯著降低但仍高于PBS組小鼠;病理半定量分析表明Ad-A20組小鼠腎小球和腎小管活動(dòng)度計(jì)分僅稍高于BPS組小鼠，而Ad-A20組小鼠腎小球和腎小管活動(dòng)度計(jì)分顯著低于Pristane組和Ad-control組小鼠。小鼠2

12、4小時(shí)尿液白蛋白檢測(cè)表明Pristane組小鼠尿液白蛋白顯著高于PBS組小鼠，而Ad-A20組小鼠尿液白蛋白低于Ad-control組小鼠;Pristane組和Ad-control組小鼠腎臟CCL2和F4/80表達(dá)水平顯著高于PBS組小鼠，而Ad-A20治療組小鼠CCL2和F4/80表達(dá)水平則較Ad-control組顯著降低;Pristane組和Ad-control組小鼠p-IκB和p-NF-κBp65表達(dá)水平顯著高于PBS組小鼠，而A

13、d-A20治療組小鼠p-IκB和p-NF-κBp65表達(dá)水平則較Ad-control組顯著降低;Pristane組和Ad-control組小鼠NLRP3、 ASC和Caspase-1p20表達(dá)水平顯著高于PBS組小鼠，而Ad-A20治療組小鼠NLRP3、 ASC和Caspase-1p20表達(dá)水平則較Ad-control組顯著降低。
　　結(jié)論:
　　腺病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)A20緩解了pristane誘導(dǎo)的SLE模型小鼠炎癥和腎臟損