登革2型病毒與內(nèi)皮細(xì)胞表面整合素β-,3-相互作用的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)用DV2感染真皮微血管來(lái)源的HMEC-1和來(lái)源于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的ECV304細(xì)胞株，檢測(cè)DV2在兩種內(nèi)皮細(xì)胞中的增殖規(guī)律，病毒感染后細(xì)胞表面整合素的表達(dá)及功能的變化，以及細(xì)胞表面的整合素在DV2感染中的作用，探討DV2感染與VEC相互作用的分子機(jī)制。主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： (1)DV2感染可以上調(diào)整合素β<,3>在HMEC-1和ECV304細(xì)胞中的表達(dá) 首先，采用流式細(xì)胞技術(shù)，檢測(cè)DV2感染的HMEC-1及ECV3

2、04細(xì)胞表面的整合素β<,1>和β<,3>的表達(dá)，樣品的平均熒光強(qiáng)度代表了整合素的表達(dá)量。在整合素β<,3>的檢測(cè)中，HMEC-1感染后24hr，感染組平均熒光強(qiáng)度略高于對(duì)照組，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品的平均熒光強(qiáng)度逐漸增加，在感染后72hr達(dá)到峰值，是對(duì)照組的2.54倍(P<0.01，n=3)。說(shuō)明DV2感染增強(qiáng)了整合素β<,3>在HMEC-1中的表達(dá)。整合素β<,1>的表達(dá)量于感染前后沒(méi)有明顯變化。ECV304細(xì)胞感染后，整合素β<

3、,1>和β<,3>呈現(xiàn)了與HMEC-1相似的變化趨勢(shì)。用感染復(fù)數(shù)(MOI)為1的病毒量感染HMEC-1時(shí)，上清中的病毒量于感染后72hr達(dá)峰值，為1.6×10<'5>PFU/ml。這與感染后整合素β<,3>高表達(dá)的時(shí)相點(diǎn)一致，提示DV2對(duì)細(xì)胞的感染可能誘導(dǎo)了整合素β<,3>的表達(dá)。 同時(shí)，我們用實(shí)時(shí)定量(real time)RT-PCR的方法檢測(cè)整合素β<,3>的mRNA水平。利用2<'-△△Ct>的分析方法分析，整合素β<,3

4、>的mRNA水平在DV2感染：HMEC-1后逐漸升高，在感染后72hr達(dá)到峰值，是對(duì)照組的14.48倍(p<0.01，n=3)，與流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果趨勢(shì)一致。進(jìn)一步證明DV2感染能夠上調(diào)整合素β<,3>的表達(dá)。 我們的結(jié)果與Raymond等在漢坦病毒的研究結(jié)果一致，Raymond等研究發(fā)現(xiàn)致病性漢坦病毒可以選擇性抑制整合素β<,3>直接介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞移行，流式細(xì)胞分析顯示整合素β<,3>的表達(dá)量明顯升高。其原因目前尚不清楚，但

5、我們知道整合素β<,3>是細(xì)胞表面的一種糖蛋白受體，通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)的親和力的變化，控制細(xì)胞的粘附和移行。整合素β3正常的生理功能的發(fā)揮有賴(lài)于這種受體與配體結(jié)合/解離的平衡。所以?xún)煞N出血熱病毒均可引起整合素β<,3>的表達(dá)量升高，而臨床上卻表現(xiàn)為出血、血漿滲出，這一看似矛盾的現(xiàn)象可能是由于整合素β<,3>過(guò)量表達(dá)，引起了細(xì)胞粘附與移行這一平衡的紊亂，造成血管通透性變化所致。DV2感染上調(diào)整合素的表達(dá)對(duì)整合素β<,3>功能的影響有待進(jìn)一步

6、研究。 對(duì)于DV2感染后整合素表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制，我們也做了初步的研究。蛋白質(zhì)的mRNA水平高，一般由兩方面因素決定，一是啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)錄水平增高；二是mRNA降解減緩，導(dǎo)致的mRNA半衰期的延長(zhǎng)。對(duì)于前者比較容易確定，本實(shí)驗(yàn)即用整合素啟動(dòng)子系列報(bào)告基因載體pGL3-1k和pGL3-1.3K，檢測(cè)DV2感染后整合素表達(dá)上調(diào)是否由于整合素啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)錄水平增高造成的。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，無(wú)論是ECV304細(xì)胞還是Ve

7、ro細(xì)胞，DV2感染后各時(shí)相點(diǎn)，整合素啟動(dòng)子的活性均沒(méi)有明顯的變化。那么整合素表達(dá)量的變化，可能是病毒感染導(dǎo)致的mRNA降解減緩，mRNA半衰期的延長(zhǎng)造成的，其中具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步證明。 (2)免疫熒光染色顯示HMEC-1中整合素β<,3>與DV2的E蛋白共存 用整合素β<,3>的單克隆抗體與DV2 E蛋白的抗體對(duì)DV2感染后的HMEC-1進(jìn)行免疫熒光雙染色。未感染的HMEC-1用整合素β<,3>的單克隆抗體染色

8、，呈現(xiàn)較弱的熒光。感染后24hr熒光的強(qiáng)度無(wú)明顯變化，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，整合素β<,3>抗原的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在感染后48hr和72hr，細(xì)胞均呈現(xiàn)較強(qiáng)的熒光。整合素β<,3>抗原主要分布在核周和細(xì)胞膜上，與細(xì)胞內(nèi)的DV2 E蛋白抗原有明顯的共存。利用ECV304細(xì)胞，實(shí)施相同的感染實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果與HMEC-1一致。整合素β<,1>抗原在感染前后的熒光強(qiáng)度沒(méi)有明顯變化，提示整合素β<,3>可能與DV2的感染過(guò)程密切相關(guān)。 (

9、3)阻斷整合素αvβ<,3>的功能可部分的抑制DV2進(jìn)入HMEC-1和ECV304細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)先用整合素β<,1>，αv，αvβ<,3.的功能阻斷抗體或配體纖維結(jié)合蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和玻粘蛋白(vitronectin，VTN)與培養(yǎng)細(xì)胞共孵育，觀察對(duì)DV2進(jìn)入細(xì)胞的抑制作用。在25μg/ml的濃度下，整合素αv和αvβ<,3>的功能阻斷抗體分別可以抑制30％and38％的DV2進(jìn)入HMEC-1。100μg/ml

10、的FN和VTN的阻斷效率分別為32％和23％(n=3)。整合素β<,1>的功能阻斷抗體，牛血清白蛋白(BSA)以及正常小鼠的IgG1在相應(yīng)的濃度下均未出現(xiàn)阻斷效果。利用ECV304細(xì)胞，實(shí)施相同的感染進(jìn)入阻斷實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果與HMEC-1一致。提示整合素β<,3>在DV2進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程中可能發(fā)揮比較重要的作用。 (4)可溶性整合素αvβ<,3>可以有效的阻斷DV2進(jìn)入HMEC-1和ECV304細(xì)胞 為進(jìn)一步證明整合素αvβ

11、<,3>在介導(dǎo)DV2進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞中的特異性作用，在實(shí)施DV2感染實(shí)驗(yàn)之前，先用可溶性的整合素αvβ<,3>或αvβ<,3>與病毒孵育?？扇苄缘恼纤卅羦β<,3>可以有效的阻斷DV2的感染，其阻斷作用具有劑量依賴(lài)特性。在2.5μg/ml的濃度下，僅出現(xiàn)部分阻斷作用，當(dāng)濃度達(dá)到10μg/ml時(shí)，阻斷率幾乎可達(dá)100％。而可溶性整合素αvβ5在10μg/ml的濃度時(shí)僅僅可以阻斷約23％的病毒感染(n=3)。BSA則幾乎沒(méi)有阻斷作用。結(jié)果提示

12、整合素αvβ<,3>可能特異性的與DV2相互作用，從而阻斷病毒感染細(xì)胞。 (5)RNA干擾方法下調(diào)整合素β<,3>的表達(dá)，可降低DV2的感染率 為進(jìn)一步證實(shí)整合素αvβ<,3>是否為DV2進(jìn)入宿主細(xì)胞所必需的，我們用RNA干擾的方法下調(diào)整合素β<,3>的表達(dá)。構(gòu)建特異性針對(duì)人整合素β<,3>的干擾質(zhì)粒p1262和p1932，轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞后48hr用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的干擾效果：轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)

13、度均比對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pSlienser)有明顯下降，提示本次構(gòu)建的干擾質(zhì)粒確實(shí)可以降低整合素β<,3>的表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上，我們通過(guò)G418，篩選了低表達(dá)整合素β<,3>的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。經(jīng)過(guò)2輪篩選，共得到5個(gè)細(xì)胞克隆，其中轉(zhuǎn)染p1262的有兩株(G6，F(xiàn)8)，轉(zhuǎn)染p1932的有三株(9-1，F(xiàn)10，G10)，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示G6中整合素β<,3>的表達(dá)水平下降最為明顯，僅為對(duì)照組的38％。我們將G6克隆命名為ECV-β<,3>

14、(-)。利用上述細(xì)胞株進(jìn)行DV2感染實(shí)驗(yàn)，與對(duì)照組相比，在ECV-β<,2>(-)中，DV2的感染率下降了89％，提示整合素β<,3>可能是DV2進(jìn)入ECv304細(xì)胞所必需的。 (6)在CHO-K1細(xì)胞中重建整合素β<,3>受體可以提高DV2的感染率 CHO-K1是來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢上皮的細(xì)胞系，常用于異源整合素的表達(dá)。用DV2感染CHO-K1細(xì)胞后不同時(shí)相點(diǎn)取培養(yǎng)上清，進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，發(fā)現(xiàn)病毒在CHO-K1中的增

15、殖滴度較低，最高滴度為1.65×10<'4>PFU/ml。而ECV304細(xì)胞或Vero細(xì)胞，在相同的感染條件下，DV2的最高滴度可達(dá)1.34×10<'6>pFU/ml和1×10<'7>pFU/ml。本實(shí)驗(yàn)將表達(dá)人整合素β<,3>的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，用G418篩選單克隆細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)，建立了穩(wěn)定表達(dá)整合素β<,3>的CHO-K1細(xì)胞。利用該細(xì)胞株進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，觀察了人整合素β<,3>穩(wěn)定表達(dá)的CHO-K1對(duì)DV2易感性的變

16、化。 與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照組CHO-K1細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)DV2進(jìn)入穩(wěn)定表達(dá)整合素β<,3>的CHO-K1細(xì)胞株的病毒量有所增高，增高的比例與整合素β<,3>的表達(dá)增高趨勢(shì)基本一致，進(jìn)一步說(shuō)明了整合素αvβ<,3>在DV2感染過(guò)程有重要作用。CHO-F8細(xì)胞是所篩選到的整合素β<,3>表達(dá)最高的細(xì)胞克隆，感染后0hr進(jìn)入細(xì)胞中的病毒為5×10<'2>pFU，而相同的感染條件下進(jìn)入ECV304細(xì)胞或Vero細(xì)胞的病毒可達(dá)5×10<'4>

17、pFU。因此認(rèn)為，整合素β<,3>是DV2進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞所必需的蛋白，但不是惟一的蛋白，若要確定還有哪些蛋白參與了DV2進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)程，尚需要進(jìn)一步研究。 綜合上述結(jié)果，DV2感染可以誘導(dǎo)整合素β<,3>高水平的表達(dá)，整合素β<,3>的表達(dá)上調(diào)可能有助于病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為揭示整合素β<,3>在DV感染的病理過(guò)程中的作用提供了重要的理論基礎(chǔ)。對(duì)于整合素β<,3>與病毒蛋白的結(jié)合位點(diǎn)以及DV2感染上調(diào)整合素β<,3>