內皮細胞與單核-巨噬細胞的相互作用對動脈粥樣硬化的影響及通絡干預研究.pdf

1、目的：氧化低密度脂蛋白等多種致病因素均可造成血管內皮損傷，受損內皮細胞釋放趨化粘附分子促進單核細胞遷移至內皮下層成為巨噬細胞，巨噬細胞吞噬脂質后成為泡沫細胞，并進一步形成粥樣斑塊；其中M1型巨噬細胞又可釋放炎癥因子而損傷內皮細胞，內皮細胞損傷與巨噬細胞浸潤形成惡性循環(huán)，加重動脈管壁病變及斑塊的不穩(wěn)定性。因此內皮細胞損傷與單核/巨噬細胞的相互作用對動脈粥樣硬化斑塊形成及增加斑塊不穩(wěn)定性具有重要意義。本研究采用離體實驗觀察通心絡及人參皂苷R

2、b1對受損內皮細胞與單核細胞粘附及M1型巨噬細胞誘導內皮細胞凋亡的干預作用，為通心絡臨床防治動脈粥樣硬化提供實驗支撐。
　　方法：⑴實驗分為正常對照組（Control）、模型組（Model）、通心絡組（TXL）、人參皂苷Rb1組（Rb1），采用ox-LDL損傷HUVECs造成內皮細胞損傷模型并給予通心絡和人參皂苷 Rb1進行干預，檢測各組內皮細胞生存活性、線粒體膜電位、細胞內鈣離子變化及LOX-1/NF-κB信號通路相關蛋白的表達

3、，以觀察通心絡和人參皂苷Rb1對ox-LDL損傷的內皮細胞的影響。采用共培養(yǎng)的方式觀察各組內皮細胞與單核細胞的粘附，檢測內皮細胞培養(yǎng)上清中趨化粘附分子的表達及單核細胞上相應受體的表達，以觀察通心絡和人參皂苷Rb1對受損內皮細胞與單核細胞粘附的影響。⑵實驗分為正常對照組（Control）、PMA對照組（PMA）、M2組、M1組、TXL組、Rb1組。采用PMA分別聯合IL-4、LPS建立巨噬細胞極化模型并給予通心絡和人參皂苷 Rb1進行干預

4、，檢測細胞培養(yǎng)上清中M1和M2型巨噬細胞標志分子的水平及Notch信號通路相關蛋白的表達,以觀察通心絡和人參皂苷Rb1對巨噬細胞向M1型極化的影響。采用共培養(yǎng)的方式觀察各組內皮細胞的凋亡過程及凋亡相關蛋白 caspase3、bax、bcl-2的表達，以觀察通心絡和人參皂苷Rb1對M1型巨噬細胞誘導內皮細胞凋亡的影響。
　　結果：①與正常對照組比較，ox-LDL可顯著降低內皮細胞生存活性，通心絡(TXL)、人參皂苷Rb1(Rb1)可

5、提高ox-LDL損傷的內皮細胞的生存活性。②采用活細胞成像系統(tǒng)動態(tài)觀察內皮細胞線粒體膜電位變化，綠色熒光標記線粒體，紅色熒光標記線粒體膜上電勢較高位置。正常對照組紅色熒光持續(xù)存在，模型組紅色熒光較快減弱消失，TXL和Rb1組紅色熒光減弱發(fā)生較晚、程度較輕。表示TXL和Rb1可延緩并減輕ox-LDL引起的線粒體膜電位下降。③采用活細胞成像系統(tǒng)動態(tài)觀察內皮細胞鈣離子變化，綠色熒光標記鈣離子。正常對照組綠色熒光持續(xù)存在于細胞周邊部位，細胞內綠

6、色熒光分布較少，模型組細胞內綠色熒光分布較廣、程度較強，TXL和Rb1組細胞內綠色熒光分布明顯比模型組少，與正常對照組分布相似。表示通絡干預能夠抑制ox-LDL引起的內皮細胞鈣離子內流。④Western blot結果顯示，與正常對照組比較，模型組HUVEC細胞LOX-1、p38MAPK、pIκBα、NF-κBp65、pNF-κBp65蛋白表達增多，IκBα蛋白表達減少；與模型組比較， TXL和Rb1組HUVEC細胞LOX-1、p38MA

7、PK、pIκBα、NF-κBp65、pNF-κBp65蛋白的表達減少，IκBα蛋白表達增加。表示ox-LDL能促進內皮細胞LOX-1的表達及NF-κB信號通路的活化，TXL和Rb1能夠抑制ox-LDL誘導的內皮細胞LOX-1的表達，減少IκBα的降解并抑制NF-κB信號通路的活化。細胞免疫熒光方法觀察NF-κBp65核轉位的結果也表明TXL和Rb1能夠抑制ox-LDL引起的NF-κB信號通路活化。⑤采用共培養(yǎng)及活細胞染色的方法觀察內皮細

8、胞與單核細胞的粘附，用hoechst-33342細胞核藍色染料對單核細胞進行活細胞染色。結果顯示，與正常對照組比較，模型組粘附于內皮細胞的單核細胞數量明顯增多，與模型組比較，TXL和Rb1組粘附于內皮細胞的單核細胞數量明顯減少。表明TXL和Rb1能抑制受損內皮細胞與單核細胞的粘附。⑥ELISA結果顯示，與正常對照組比較，模型組內皮細胞培養(yǎng)上清中MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1的水平升高，與模型組比較，TXL和Rb1組內皮細胞培

9、養(yǎng)上清中MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1的水平顯著降低。表示TXL和Rb1能夠抑制ox-LDL引起的內皮細胞趨化粘附分子的表達。⑦qRT-PCR結果顯示，與正常對照組比較，模型組THP-1細胞CCR2、Mac-1、VLA4 mRNA表達升高，與模型組比較，TXL和Rb1組THP-1細胞CCR2、Mac-1、VLA4 mRNA表達降低。Western blot結果顯示，與正常對照組比較，模型組THP-1細胞CCR2、Mac-1、

10、VLA4蛋白表達升高；與模型組比較，TXL和Rb1組THP-1細胞CCR2、Mac-1、VLA4蛋白表達降低。以上結果表明，TXL和Rb1能夠抑制受損內皮細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的CCR2、Mac-1、VLA4的表達。⑧與正常對照組比較，PMA組IL-10、IL-6、TNF-α的水平無統(tǒng)計學差異，說明實驗濃度的PMA對巨噬細胞極化表型沒有影響。與正常對照組比較， M2組IL-10水平升高，IL-6、TNF-α的水平無統(tǒng)計學差異；與正常對照組和

11、M2組比較，M1組細胞培養(yǎng)上清中IL-10水平明顯降低，IL-6、TNF-α水平明顯升高，說明M2和M1型巨噬細胞模型建立成功。與M1組比較， TXL和Rb1組細胞培養(yǎng)上清中IL-10的水平升高，IL-6、TNF-α的水平下降，說明TXL和Rb1可以抑制LPS誘導的巨噬細胞向M1型極化。⑨Western blot結果顯示，正常對照組與PMA組比較，Notch-1、active Notch-1、DLL4、Hes-1的蛋白表達無統(tǒng)計學差異，

12、表明實驗濃度的PMA沒有對Notch信號通路產生影響。與正常對照組和M2組比較， M1組Notch-1蛋白表達無統(tǒng)計學差異，active Notch-1、DLL4、Hes-1的蛋白表達明顯升高；與M1組比較，TXL和Rb1組active Notch-1、DLL4、Hes-1的蛋白表達顯著降低。以上結果表明，TXL和Rb1可以抑制LPS誘導的巨噬細胞Notch信號通路的活化。⑩采用共培養(yǎng)方式以活細胞成像系統(tǒng)動態(tài)觀察各組內皮細胞的凋亡過程。

13、結果顯示，正常對照組HUVEC細胞核形態(tài)規(guī)整，邊緣清晰，熒光強度彌散均一，可見細胞分裂增殖；PMA組和M2組HUVEC細胞核觀察初期與正常對照組無明顯差別，觀察后期可見細胞核固縮碎裂；M1組HUVEC細胞核較早出現濃染、固縮、邊緣化，細胞核體積縮小，核碎裂，產生凋亡小體。TXL組和Rb1組HUVEC細胞核形態(tài)較M1組規(guī)整，邊緣較清晰，核濃染、固縮、邊緣化等現象發(fā)生較晚，程度較輕，并可見細胞分裂增殖。
　　結論：⑴通心絡和人參皂苷R

14、b1可以抑制ox-LDL引起的內皮細胞LOX-1/NF-κB信號通路的活化，部分阻止線粒體膜電位下降和鈣離子內流，起到改善受損內皮細胞功能，減少趨化、粘附分子表達的作用。并進一步減少由于內皮細胞損傷引起的單核細胞粘附及單核細胞趨化粘附分子受體的表達。⑵通心絡和人參皂苷Rb1可以抑制LPS誘導的巨噬細胞Notch信號通路活化，部分阻止巨噬細胞向 M1型極化，減少炎癥因子表達，減輕M1型巨噬細胞引起的內皮細胞凋亡。⑶通心絡和人參皂苷 Rb1