oxLDL與動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性研究——oxLDL與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系的臨床觀察研究——體外阻斷oxLDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景: 以動(dòng)脈粥樣硬化（atheroselerosis，AS）為主要病理改變的心腦血管疾病嚴(yán)重威脅著人類。動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前得到廣泛認(rèn)可的為損傷-反應(yīng)學(xué)說(shuō)和由此發(fā)展的炎癥理論。免疫機(jī)制在AS的形成、發(fā)展中起重要作用，多種參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞和分子相互協(xié)同、相互影響，促進(jìn)了AS的發(fā)生發(fā)展。氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoproteirt，oxLDL）在AS中的作用正日益受到重視。O

2、xLDL是低密度脂蛋白（LDL）在體內(nèi)發(fā)生氧化修飾而形成的，此反應(yīng)與體內(nèi)的氧化應(yīng)激有關(guān)。LDL氧化修飾后，理化性質(zhì)和生物學(xué)特性均發(fā)生了一系列改變，可以通過(guò)細(xì)胞毒性作用、化學(xué)趨化作用、影響血管平滑肌增殖、加速泡沫細(xì)胞形成、影響纖溶和凝血等機(jī)制促進(jìn)AS的發(fā)生和進(jìn)展。另外，oxLDL具有免疫原性，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性自身抗體（oxLDL-Ab）。氧化低密度脂蛋白及其抗體均參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，在疾病的進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用，對(duì)其

3、研究很多，但是，目前研究結(jié)論卻有很大的差異，有些甚至十分矛盾。有些病例對(duì)照研究表明病人體內(nèi)oxLDL和oxLDL-Ab水平顯著高于正常對(duì)照，oxLDL的水平可提供重要的診斷信息，oxLDL-Ab可作為動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；然而也有研究報(bào)道oxLDL-Ab水平與動(dòng)脈粥樣硬化程度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，oxLDL-Ab可發(fā)揮保護(hù)作用。這些相互矛盾的結(jié)果反映了動(dòng)脈粥樣硬化中免疫機(jī)制的復(fù)雜性。 動(dòng)脈粥樣硬化是多階段慢性演變的過(guò)程，包括血管內(nèi)皮

4、損傷、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞粘附和侵入內(nèi)皮轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞、脂紋形成，平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜增生形成纖維斑塊，之后逐步演變?yōu)橹鄻影邏K，斑塊不穩(wěn)定或破裂導(dǎo)致臨床上急性事件的發(fā)生等復(fù)雜過(guò)程。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊主要侵犯彈性型的大動(dòng)脈和中等管徑的動(dòng)脈，其中頸動(dòng)脈是腦供血的主要通路，此部位的粥樣硬化斑塊越來(lái)越多地被發(fā)現(xiàn)。頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊導(dǎo)致狹窄從而引起血流動(dòng)力學(xué)改變的并不多，相對(duì)來(lái)講，粥樣斑塊的性質(zhì)更為重要。病變?nèi)籼幱诜€(wěn)定期則影響不大，而不穩(wěn)定時(shí)斑塊潰破

5、可直接導(dǎo)致腦卒中的發(fā)生。腦卒中具有高的病死率和致殘率，對(duì)人體危險(xiǎn)性很大。對(duì)不穩(wěn)定斑塊行外科手術(shù)切除為該病的二級(jí)預(yù)防提供了新途徑。因此，對(duì)斑塊穩(wěn)定性的分析和研究非常重要。本文對(duì)確診有頸動(dòng)脈粥樣硬化病變但病變處于穩(wěn)定期的高危險(xiǎn)性人群進(jìn)行流行病學(xué)研究，分析血脂、ox-LDL、oxLDL-Ab及其它危險(xiǎn)因素與頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)聯(lián)，可為AS的防治提供基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 OxLDL可通過(guò)多種作用途徑促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，其中

6、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡為其初始作用之一。細(xì)胞凋亡即程序性細(xì)胞死亡，是生物體內(nèi)廣泛存在的一種為維護(hù)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞接受某種信號(hào)或受到某些因素刺激后由特定基因控制的、以細(xì)胞DNA有控降解為特征的、無(wú)明顯細(xì)胞溶解現(xiàn)象的細(xì)胞自主有序性死亡。細(xì)胞凋亡在AS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，尤其是內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡機(jī)制參與了動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的各過(guò)程，可影響內(nèi)皮細(xì)胞正常功能、促進(jìn)血栓形成、參與血管重構(gòu)、影響動(dòng)脈形態(tài)與結(jié)構(gòu)，具有重要意義。 大蒜及從中提

7、取的大蒜油具有廣泛的藥理作用，包括抗病原微生物、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能、抗氧化、抗衰老、保護(hù)肝臟、防治糖尿病等，尤其可通過(guò)多種機(jī)制對(duì)心腦血管系統(tǒng)疾病產(chǎn)生顯著的預(yù)防和治療作用，其中，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞為其機(jī)制之一。人體必需微量元素硒（Se）也對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用，其水平與心血管疾病的發(fā)病率呈明顯負(fù)相關(guān)，還具有抗氧化、解毒等其他多方面生物學(xué)效應(yīng)。大蒜和硒聯(lián)合應(yīng)用是否能發(fā)揮協(xié)同保護(hù)作用是該領(lǐng)域一直關(guān)注的問(wèn)題。但是由于大蒜油的PH在5．3到5．

8、8之間，而亞硒酸鈉的PH為11．0左右，兩者直接混合聯(lián)用會(huì)破壞大蒜素；而且亞硒酸鈉中的硒為無(wú)機(jī)硒，其在體內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)換率難以確定。采用微膠囊技術(shù)可將大蒜油和硒聯(lián)合，然而這種劑型很難用實(shí)驗(yàn)研究確定其效能。富硒大蒜的培育開發(fā)為將二者聯(lián)合應(yīng)用、評(píng)價(jià)其可能的保健或治療作用提供了契機(jī)。 已有研究證明，富硒大蒜可保護(hù)心腦血管系統(tǒng)，但具體機(jī)制目前尚未闡明，尤其對(duì)oxLDL所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用尚未見(jiàn)研究報(bào)道。因此，本文以山東蒼山培育的富硒大蒜

9、為原料，從中提取大蒜油，測(cè)定其中大蒜素和硒的含量；并用ox-LDL作用于體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304細(xì)胞株）誘導(dǎo)其凋亡，進(jìn)而用提取的富硒大蒜油進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的阻斷作用，并對(duì)作用機(jī)理進(jìn)行初步探討。 研究目的: 本文以頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚和/或有斑塊形成、但未發(fā)生急性臨床事件者為病例，以頸動(dòng)脈正常者為對(duì)照，運(yùn)用單純病例研究和病例對(duì)照研究，分析血脂、ox-LDL、oxLDL-Ab及其它危險(xiǎn)因

10、素與頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)聯(lián)，并分析oxLDL與自身抗體的關(guān)系，以了解與AS有關(guān)聯(lián)的免疫機(jī)制，為AS的防治研究提供科學(xué)依據(jù)。 用oxLDL作用于體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304，誘導(dǎo)其凋亡，進(jìn)而用提取的富硒大蒜油進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞存活率、細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及其mRNA水平的變化以研究oxLDL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，探討富硒大蒜油對(duì)此損傷的影響及可能機(jī)制，確定其是否有保護(hù)作用及所需劑量，為進(jìn)一步研究

11、其預(yù)防AS的功能提供基礎(chǔ)。 研究?jī)?nèi)容和方法: 一．oxLDL與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系的臨床觀察研究 1．研究對(duì)象的選擇; 2．頸動(dòng)脈超聲檢查; 4．實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)容和方法; 5．統(tǒng)計(jì)方法。 二．體外阻斷oxLDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究 采用乙醇提取加橄欖油萃取法和水蒸氣蒸餾加橄欖油萃取法分別從一般大蒜和富硒大蒜中提取大蒜油，同時(shí)制備大蒜勻漿，采用高效液相色譜法測(cè)定處理后不同組分大蒜

12、素含量，氫化物發(fā)生原子熒光法測(cè)定其中的硒含量。采用銅離子誘導(dǎo)法將LDL體外氧化修飾成oxLDL，蘇丹黑預(yù)染的瓊脂糖凝膠電泳及TBARS測(cè)定法鑒定LDL氧化程度。應(yīng)用水蒸氣蒸餾加橄欖油萃取法所得大蒜油進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。ECV304細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％新生牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，其中青霉素、鏈霉素濃度均為100U/mL，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2、飽和濕度。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ECV304細(xì)胞用0．25％胰蛋白酶消化，用含

13、10％新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為2×104/ml，取適量細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶。臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率；甲基四唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞活性，求得10％的細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制所需要的一般大蒜油、富硒大蒜油及無(wú)機(jī)硒標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（IC10），選取低于IC10的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為8組：對(duì)照組、oxLDL組、一般大蒜油組、oxLDL+一般大蒜油組、富硒大蒜油組、oxLDL+富硒大蒜油組、硒標(biāo)準(zhǔn)溶液組、oxLDL+

14、硒標(biāo)準(zhǔn)溶液組。所加一般大蒜油終濃度為5μl/L，富硒大蒜油終濃度為2．5μl/L，硒標(biāo)準(zhǔn)溶液終濃度為0．02μg/ml，oxLDL終濃度為22μg/ml。其中oxLDL+大蒜油組為先加入大蒜油作用24h后再加oxLDL作用。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI染色法測(cè)定細(xì)胞凋亡率。對(duì)照組、oxLDL組、富硒大蒜油組、oxLDL+富硒大蒜油組瑞氏-吉姆薩染色光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，Western blot測(cè)

15、定細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3的表達(dá)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)Bcl-2、Bax和caspase-3mRNA水平的變化。 結(jié)論: 1．對(duì)于頸動(dòng)脈粥樣硬化病變穩(wěn)定期的病人，體內(nèi)血液循環(huán)中的氧化低密度脂蛋白（oxLDL）與其自身抗體（oxLDL-Ab）水平無(wú)關(guān)。 2．血液循環(huán)中的o

16、xLDL在頸動(dòng)脈粥樣硬化病人體內(nèi)顯著高于對(duì)照，但在穩(wěn)定期病例中與病變的程度無(wú)關(guān)。 3．血液循環(huán)中的oxLDL-Ab在頸動(dòng)脈粥樣硬化病人體內(nèi)顯著低于對(duì)照，但在穩(wěn)定期病例中與病變的程度無(wú)關(guān)。 4．oxLDL及oxLDL-Ab可預(yù)測(cè)AS的危險(xiǎn)性，可作為高危人群是否需要進(jìn)行AS斑塊檢查的初篩指標(biāo)。 5．oxLDL具有明顯的細(xì)胞毒作用，可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，此作用可能是通過(guò)影響B(tài)cl-2、Bax和caspase-3的基