骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞對動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮的修復(fù)作用.pdf

1、心血管系統(tǒng)疾病是現(xiàn)代社會嚴(yán)重威脅人類健康,引起死亡的主要疾病。動脈粥樣硬化(AS)是心血管疾病的主要病因之一,阻止AS的進(jìn)展已成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。許多心血管疾病發(fā)生的危險因素,如老年、吸煙、糖尿病、高血壓、高脂血癥等都會造成以內(nèi)皮細(xì)胞合成一氧化氮(NO)能力下降,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變?yōu)橹饕攸c(diǎn)的血管內(nèi)皮功能失調(diào),血管內(nèi)皮功能失調(diào)是AS發(fā)生的第一步。AS治療應(yīng)包括早期阻止內(nèi)皮功能失調(diào)、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、防止AS斑塊進(jìn)展。如何對損傷

2、的內(nèi)皮進(jìn)行修復(fù),已成為AS研究的重點(diǎn)內(nèi)容。
　　 研究表明內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)具有修復(fù)和替代損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。將體外培養(yǎng)的EPC輸入血管受損的大鼠體內(nèi),能促進(jìn)內(nèi)皮再生；生理?xiàng)l件下,輕微受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞可以通過鄰近細(xì)胞的增殖得到修復(fù),而強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的內(nèi)膜損傷則要通過循環(huán)中EPC歸巢到損傷部位來修復(fù)。
　　 研究發(fā)現(xiàn),在成體外周組織,包括某些正常及損傷血管壁附近均存在一類具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征的細(xì)胞,這些

3、細(xì)胞可能參與了血管組織更新和損傷后的修復(fù)過程。離體研究證實(shí)骨髓MSC在一定條件下可分化為ECs,分化后的MSC表達(dá)ECs特有標(biāo)志,如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(KDR)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體1(F1k-1)及血管細(xì)胞黏附分子(VCAM.1)等；此外間充質(zhì)干細(xì)胞可能分泌多種細(xì)胞因子,為受損血管的修復(fù)和新血管的生成提供了適當(dāng)?shù)奈h(huán)境。
　　 本研究旨在建立高脂飲食導(dǎo)致的動脈粥樣硬化模型,研究大鼠骨髓來源的EPC和MSC對動脈粥樣

4、硬化的治療作用,比較兩者的治療效果,尋找AS細(xì)胞治療的有效方法。
　　 目的：
　　 分離培養(yǎng)大鼠骨髓EPC和MSC,研究其生物學(xué)特性。
　　 方法：
　　 1、無菌條件下取大鼠股骨,沖出骨髓細(xì)胞,用大鼠淋巴細(xì)胞分離液分離出單個核細(xì)胞,將其重懸在MSC培養(yǎng)液中培養(yǎng),檢測其生物學(xué)特性(流式和免疫組化分析表面標(biāo)志、生長特性)及多向分化潛能(向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化)。
　　 2、分離大鼠骨髓單個核細(xì)胞

5、,將其重懸在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志(vWF、CD31、CD144),通過LYEA-1結(jié)合能力、乙?；兔芏戎鞍?Dil-Ac-LDL)攝取能力的檢測鑒定培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞,并研究細(xì)胞的生長特性和克隆形成能力。結(jié)果
　　 1、骨髓MSC的生物學(xué)特性:第三代貼壁細(xì)胞均表達(dá)MSC表面標(biāo)志物CD29,CD90,不表達(dá)CD34、CD45造血細(xì)胞表面標(biāo)志和CD31、vWF內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志。第三代MSC接種

6、后第1～2天生長較緩慢,從第3天起細(xì)胞開始增殖并進(jìn)入對數(shù)生長期,細(xì)胞迅速增殖。根據(jù)公式DT=t×1g2/(1gNt-1gN0),得出MSC倍增時間49.13±0.7h。
　　 2、培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在特定的培養(yǎng)條件下具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化的能力,符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞判斷的金標(biāo)準(zhǔn)。
　　 3、培養(yǎng)的EPC vWF、CD31、CD144表達(dá)陽性,具有與UEA-1結(jié)合能力和攝取DiI-AC-LDI的能力。EPC的生長

7、特性為:接種后第1～6d為潛伏期,從第6 d起細(xì)胞開始增殖并進(jìn)入對數(shù)生長期。不同傳代次數(shù)之間的EPC其增值能力存在差異,P2代細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于P5代,它們的增殖能力在第8天顯示出差異(p<0.05),第10天出現(xiàn)顯著差異(p<0.01),P2和P5EPC的倍增時間分別為:82.70±4.28h和90.88±5.30h。骨髓EPC具有克隆形成能力,并且克隆形成的數(shù)目與再種植細(xì)胞數(shù)量之間呈良好的線性關(guān)系,接種4000、6000、8000、1

8、0000個細(xì)胞可分別形成22.00±3.60、33.67±5.13、42.00±3.00、61.00±4.58個內(nèi)皮細(xì)胞集落。
　　 結(jié)論：
　　 從大鼠骨髓單個核細(xì)胞成功分離培養(yǎng)獲得MSC和EPC。
　　 目的：
　　 建立SD大鼠動脈硬化模型；觀察大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老改變。
　　 方法：
　　 1、SD大鼠28只,隨機(jī)分為A、B、C、D4組,每組7只。A組喂食普通飼料,B、C、D組喂食

9、高脂飼料。大鼠高脂飼料喂養(yǎng)12周后測定血脂的變化,HE染色分析主要動脈血管結(jié)構(gòu)的改變。
　　 2、膠原酶灌注方法,分離胸主動脈和腎動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法,鑒定內(nèi)皮細(xì)胞；應(yīng)用細(xì)胞化學(xué)染色的方法檢測衰老相關(guān)的半乳糖甘酶(SA—B—gal)活性。
　　 結(jié)果：
　　 1、SD雄性大鼠高脂飼料喂養(yǎng)12周后,大鼠血液甘油三脂、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平明顯升高；高脂血癥大鼠動脈血管出現(xiàn)明顯的粥樣硬化

10、改變。
　　 2、分離培養(yǎng)后的胸主動脈和腎動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)vWF,CD31；高脂飲食后的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老增加,SA—β—gal活性明顯增加。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功建立SD大鼠動脈粥樣硬化模型。
　　 2、高脂血癥引起大鼠動脈結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變,動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老增加,SA—B—gal活性增加。
　　 目的：
　　 研究大鼠骨髓來源的EPC和MSC對動脈粥樣硬化治療的效果。<

11、br>　　 方法：
　　 1、包裝、純化rAAV2-IRES-GFP,并轉(zhuǎn)染EPC和MSC。
　　 2、將轉(zhuǎn)染了rAAV2-IRES-GFP的EPC和MSC經(jīng)尾靜脈分別移植入高脂飲食大鼠體內(nèi),病理對照組注射生理鹽水。注射后兩個月,檢測血脂水平；HE染色觀察主動脈的組織學(xué)改變；冰凍切片熒光顯微鏡下觀察GFP標(biāo)記的細(xì)胞。
　　 3、RT-PCR檢測主動脈壁一氧化氮合酶(eNOS)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)及

12、載脂蛋白E(apoE)mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 與病理對照組比較,EPC和MSC細(xì)胞治療后大鼠血脂水平呈明顯下降趨勢,動脈壁脂質(zhì)沉積減少；主動脈冰凍切片中可以檢測到GFP標(biāo)記的細(xì)胞,細(xì)胞排列整齊,襯在血管內(nèi)膜上；動脈璧ICAM-1的mRNA表達(dá)水平明顯降低,而apoE及eNOSmRNA的表達(dá)水平與正常對照組相比有明顯的增高,三種基因的表達(dá)以EPC治療組改變最為顯著,提示EPC對動脈粥樣硬化的修復(fù)作用優(yōu)于MSC