VEGF分別與bFGF、aFGF聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞.pdf

1、種子細(xì)胞的選擇是進(jìn)行細(xì)胞組織工程研究的基礎(chǔ)。胚胎干細(xì)胞作為一種全能干細(xì)胞，是最理想的種子細(xì)胞，但是在獲取胚胎干細(xì)胞的過(guò)程中需要破壞囊胚，存在倫理學(xué)爭(zhēng)議，并且將胚胎干細(xì)胞移植入個(gè)體后會(huì)引起免疫排斥并導(dǎo)致畸胎瘤，因而限制了它在科研和臨床中的應(yīng)用。
　　 隨著研究的深入，學(xué)者發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞不存在以上問(wèn)題，逐漸成為細(xì)胞組織工程研究的熱點(diǎn)。首先，間充質(zhì)干細(xì)胞是一種起源于中胚層間質(zhì)的成體干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體

2、外環(huán)境下可以向多種細(xì)胞分化，特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來(lái)源的組織細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，并且經(jīng)過(guò)體外傳代擴(kuò)增以后仍然能夠保持這種干細(xì)胞特性。其次，間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源廣泛，在胎兒及成體的骨髓、骨膜、脂肪、乳牙、臍帶等多種組織中均有存在，分離獲取間充質(zhì)干細(xì)胞不需要破壞囊胚，因而不存在倫理道德問(wèn)題。再者，間充質(zhì)干細(xì)胞還具有免疫調(diào)節(jié)功能，可以通過(guò)細(xì)胞間的相互作用及產(chǎn)生細(xì)胞因子抑制T細(xì)胞的增殖及其免疫反應(yīng)，從

3、而發(fā)揮免疫重建的功能，進(jìn)行自體移植也不存在免疫排斥反應(yīng)，并且已經(jīng)有許多研究結(jié)果顯示成體干細(xì)胞治療不會(huì)引發(fā)畸胎瘤。
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中含量最高，但也僅占有核細(xì)胞的0.001％-0.01％。目前分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法主要有:全骨髓貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法和免疫磁珠法，前兩種方法操作簡(jiǎn)便，但僅用其中一種方法很難實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的純化，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)研究產(chǎn)生不良的影響，后兩種方法分離出來(lái)的細(xì)胞純度較高，但操作過(guò)程復(fù)雜，費(fèi)

4、用昂貴，不能得到廣泛推廣。目前多采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選的方法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但這種方法分離出來(lái)的間充質(zhì)干細(xì)胞的純度如何，細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代以后的活力是否發(fā)生變化，目前缺乏較為系統(tǒng)而全面的評(píng)估。
　　 體內(nèi)、外的許多研究顯示間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子在此過(guò)程中發(fā)揮主要作用，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可以創(chuàng)造有利于間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的微環(huán)境，具有協(xié)同誘導(dǎo)的作用，這兩種因子是目前體外

5、內(nèi)皮化誘導(dǎo)最常用的組合。酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的生物學(xué)功能相似，并且在酸性環(huán)境中其生物活性發(fā)揮的更好。在誘導(dǎo)分化過(guò)程中，細(xì)胞代謝會(huì)引起培養(yǎng)液的PH值降低，酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子有可能更好的協(xié)助血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 第一章:兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定及活力檢測(cè)
　　 目的：
　　 體外分離出兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表型及分化潛

6、能的鑒定，并對(duì)傳代后細(xì)胞的活力進(jìn)行檢測(cè)和比較。
　　 方法：
　　 1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、純化:在無(wú)菌條件下抽取兔子股骨和脛骨的骨髓，采取密度梯度離心的方法把骨髓中比重不同的細(xì)胞群分層，然后分離出含有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞，置于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，通過(guò)換液去除未貼壁的細(xì)胞，并且在傳代過(guò)程中利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易于消化的特點(diǎn)，嚴(yán)格控制胰蛋白酶的量和消化時(shí)間，去除貼壁能力較強(qiáng)的單核細(xì)胞

7、及成纖維細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純化。
　　 2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定:
　　 (1)形態(tài)學(xué):倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞在不同時(shí)期的形態(tài)特征，并進(jìn)行蘇木素—伊紅染色。
　　 (2)細(xì)胞表型:應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14、CD29、CD34、CD44、CD45以及CD90的表達(dá)。
　　 (3)分化潛能:應(yīng)用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，并進(jìn)行茜素紅染色鑒定鈣質(zhì)結(jié)節(jié);應(yīng)用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)間

8、充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，并進(jìn)行油紅0染色鑒定脂肪細(xì)胞。
　　 3、細(xì)胞活力的檢測(cè)
　　 (1)描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:選取P1、P3、P5代生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞以相同細(xì)胞數(shù)量接種于直徑為3.5 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，自第2d起每天取3個(gè)培養(yǎng)皿消化計(jì)數(shù)，每皿計(jì)數(shù)3次，取其平均值，連續(xù)8d。以時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，繪制生長(zhǎng)曲線。
　　 (2)計(jì)算細(xì)胞接種存活率:選取P1、P3、P5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以3.5×107 L

9、-1的濃度接種于直徑為3.5 cm的培養(yǎng)皿中，每隔2h隨機(jī)選取3個(gè)培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)液與未貼壁細(xì)胞，用濃度為0.25％胰蛋白酶消化，計(jì)算每個(gè)皿內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量，取平均值，計(jì)算貼壁率，連續(xù)測(cè)定18 h，以時(shí)間為橫軸，貼壁率為縱軸，繪制曲線。
　　 (3)細(xì)胞克隆形成率:選取P1、P3、P5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后以100個(gè)/孔接種于6孔板中，連續(xù)培養(yǎng)16 d，用臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆，標(biāo)準(zhǔn)為:細(xì)胞數(shù)≥50個(gè)記為為1個(gè)細(xì)胞克隆。<

10、br>　　 結(jié)果：
　　 1、形態(tài)特征:細(xì)胞在培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁生長(zhǎng)，原代細(xì)胞的形態(tài)多呈圓形、梭形和三角形，5-6 d可形成散在的細(xì)胞集落，8-10 d集落之間相互融合，細(xì)胞呈魚(yú)群狀排列。經(jīng)過(guò)貼壁篩選，細(xì)胞的同質(zhì)性和均一性逐漸提高。
　　 2、細(xì)胞表型:流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:細(xì)胞CD29、CD44、CD90的表達(dá)率分別為97.21％、98.87％和96.20％; CD14、CD34、CD45表達(dá)率分別為5.36％、0.36

11、％和2.03％。
　　 3、分化潛能:成骨誘導(dǎo)21 d，實(shí)驗(yàn)組可形成明顯的鈣質(zhì)結(jié)節(jié)，茜素紅染色后見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)呈深紅色，對(duì)照組無(wú)明顯改變。成脂誘導(dǎo)14 d，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈圓形或多邊形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)明顯脂滴形成，油紅(O)染色呈現(xiàn)鮮艷的紅色，對(duì)照組未見(jiàn)明顯變化。
　　 4、生長(zhǎng)曲線:P1、P3代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線形態(tài)相似，均呈現(xiàn)出典型的“S”形，相同時(shí)間內(nèi)P5代細(xì)胞的增殖速度相對(duì)緩慢。
　　 5、細(xì)胞接種存活率:P1、P3代細(xì)

12、胞貼壁率的變化基本一致，接種14h后貼壁率可達(dá)到96％，P5代細(xì)胞的貼壁率較P1、P3代細(xì)胞明顯低，接種14h后的貼壁率僅為87％，統(tǒng)計(jì)分析提示P1、P3代細(xì)胞貼壁率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，P5代細(xì)胞與P1、P3代細(xì)胞之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 6、細(xì)胞克隆形成率:P1、P3、P5代細(xì)胞均可形成細(xì)胞克隆，顯微鏡下可見(jiàn)克隆內(nèi)的細(xì)胞排列緊密，形態(tài)與原代細(xì)胞近似，克隆周邊可見(jiàn)散在的老化或變異的細(xì)胞。細(xì)胞

13、克隆形成率在P1、P3、P5代細(xì)胞之間的差異具有顯著性(P＜0.01)，隨著傳代次數(shù)增加克隆形成率逐漸降低。
　　 結(jié)論：
　　 1、密度梯度離心法能夠分離出具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)貼壁篩選可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的進(jìn)一步純化。
　　 2、密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選的方法分離出的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在P1至P3代能夠保持良好的細(xì)胞活力;隨著擴(kuò)增傳代，細(xì)胞活力會(huì)有不同程度的下降。
　　 3、基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)

14、胞的組織工程研究適宜在P1至P3代以內(nèi)進(jìn)行，這樣能夠保證細(xì)胞與支架的良好貼附，為進(jìn)一步的臨床治療奠定基礎(chǔ)。
　　 第二章:誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞:aFGF與bFGF生物活性的比較
　　 目的：
　　 VEGF分別與bFGF、aFGF聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、攝取功能、檢測(cè)CD31表達(dá)率及NO分泌量鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞，并統(tǒng)計(jì)分析兩種因子組合在誘導(dǎo)效率方面的差異。

15、>　　 方法：
　　 1、兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定:同第一部分。
　　 2、誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞:選取P3代生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞，接種于6孔板中。實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用含VEGF(20ng/ml)、aFGF(10ng/ml)的培養(yǎng)液誘導(dǎo)，對(duì)照組應(yīng)用含VEGF(20ng/ml)、bFGF(10ng/ml)的培養(yǎng)液誘導(dǎo)。
　　 3、血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定
　　 (1)在倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞

16、的形態(tài)變化。
　　 (2)攝取功能:采用攝取Dil標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)和結(jié)合硫氰酸熒光素標(biāo)記的結(jié)合荊豆凝集素(FITC-UEA-1)的雙染色方法進(jìn)行鑒定。熒光顯微鏡下觀察，攝取Dil-ac-LDL的細(xì)胞散發(fā)出紅色熒光，結(jié)合FITC-UEA-I的細(xì)胞散發(fā)出綠色熒光，熒光染色雙陽(yáng)性的細(xì)胞呈黃色，是具有攝取功能的內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 (3)CD31表達(dá)率:兩種因子組合誘導(dǎo)培養(yǎng)第15d和第24 d，應(yīng)用流

17、式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD31的表達(dá)。
　　 (4)NO分泌量的檢測(cè):誘導(dǎo)第15d和第24 d，取上清液，儲(chǔ)存于-80℃冰箱內(nèi)。按照NO檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以平均吸光度OD值為x軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為y軸，用Excel作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，將樣品OD值代入公式計(jì)算NO濃度。
　　 結(jié)果：
　　 1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及鑒定:同第一部分。
　　 2、內(nèi)皮細(xì)胞鑒定
　　 (1)形態(tài)學(xué)觀察:經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)以

18、后，細(xì)胞體積變小，形態(tài)為圓形、橢圓形或短梭形，形態(tài)飽滿，立體感增強(qiáng)。24 d后，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的“鋪路石”樣表現(xiàn)。
　　 (2)攝取功能:誘導(dǎo)的細(xì)胞經(jīng)過(guò)熒光染色，顯微鏡下可見(jiàn)雙染色陽(yáng)性的細(xì)胞大于50％。
　　 (3)CD31的表達(dá):誘導(dǎo)第15d，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組CD31的表達(dá)率分別為(34.20±2.90)％和(46.23±2.87)％，兩樣本t檢驗(yàn)比較差異具有顯著性(P＜0.01)，對(duì)照組的表達(dá)率較高;誘導(dǎo)第24 d，實(shí)驗(yàn)

19、組和對(duì)照組CD31的表達(dá)率分別為(53.35±2.12)％和(56.14±3.93)％，兩樣本t檢驗(yàn)比較差異沒(méi)有顯著性(P＞0.05)。
　　 (4)NO分泌量的檢測(cè):誘導(dǎo)第15 d，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組NO的分泌量分別為(70.27±3.45)μmol/L和(79.19±5.34)μmol/L兩樣本t檢驗(yàn)比較差異具有顯著性(P＜0.01)，對(duì)照組NO的分泌量較高;誘導(dǎo)第15d，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組NO的分泌量分別為(105.16±5.89