CD151基因轉(zhuǎn)移對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞整合素α3β1-α6β1表達(dá)的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建CD151囊泡運(yùn)輸基序缺陷的ARSA突變體(pAAV-CD151-ARSA 245-248突變體)，包裝病毒，并轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞，研究CD151對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞整合素表達(dá)的影響及CD151促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移的機(jī)制。
　　 方法：1. 以pAAV-CD151質(zhì)粒為模板，采用定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建CD151囊泡運(yùn)輸基序缺陷的ARSA突變體(pAAV-CD151-ARSA 245-248突變體)，并通過基因序列測(cè)序鑒定；

2、>　　 2.通過PCR技術(shù)擴(kuò)增質(zhì)粒，并提取質(zhì)粒，用聚乙二醇純化法純化質(zhì)粒；
　　 3.用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法包裝重組腺相關(guān)病毒(GFP、CD151基因及其突變體的)，通過斑點(diǎn)雜交檢測(cè)重組腺相關(guān)病毒滴度；
　　 4.原代培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞，經(jīng)倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)的鑒定，經(jīng)通過免疫熒光法檢測(cè)Ⅷ因子相關(guān)抗原；
　　 5. HUVECs細(xì)胞分組：①Control組(空白對(duì)照組)；②GFP組；③CD151組；④ CD15

3、1-ARSA組。用rAAV-GFP、rAAV-CD151和rAAV-CD151-ARSA轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：
　　 5.1 經(jīng)Western blot檢測(cè)CD151蛋白質(zhì)的表達(dá)時(shí)間梯度，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞CD151表達(dá)水平的變化；
　　 5.2 SRB染色測(cè)定細(xì)胞增殖能力，Boyden小室法測(cè)定細(xì)胞的遷移能力；
　　 5.3檢測(cè)HUVECs細(xì)胞整合素a3b1/a6b1的表達(dá)水平的變化：
　　

4、5.3.1 經(jīng)Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞a3b1/a6b1表達(dá)水平的變化；
　　 5.3.2 應(yīng)用可還原的細(xì)胞表面生物素(NHS-SS-Biotin)標(biāo)記方法研究CD151在整合素b1內(nèi)化中的作用。
　　 結(jié)果：經(jīng)過雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳及基因序列測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建了CD151-ARSA突變體；通過斑點(diǎn)雜交檢測(cè)證實(shí)成功包裝的重組腺相關(guān)病毒滴度符合本實(shí)驗(yàn)要求；用rAAV-CD151和rAAV-CD151-ARS

5、A基因轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞后，Western blot檢測(cè)四組CD151的表達(dá)水平CD151與參照β-actin表達(dá)條帶相對(duì)吸光度值依次為：0.56±0.17、0.52±0.11、1.07±0.12和1.05±0.21，表明rAAV-CD151和rAAV-CD151-ARSA基因轉(zhuǎn)染均可使HUVECs細(xì)胞中CD151蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增加(*P<0.05)；在細(xì)胞增殖能力研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD151能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，CD151組(0.552

6、8±0.0064)與Control組(0.2502±0.0039)和GFP組(0.2471±0.0094)比較細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，有顯著性差異(*P<0.05)；而CD151-ARSA組(0.1153±0.0076)細(xì)胞增殖能力最弱，比較有顯著性差異(P<0.05)(圖7)。說明CD151在HUVECs的增殖中具有重要的作用，能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增值，而CD151-ARSA則減弱內(nèi)皮細(xì)胞的增值。同樣，CD151促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。CD1

7、51組(25.78±3.19)與Control組(15.26±2.13)和GFP組(13.93±2.51)比較細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)，有顯著性差異(*P<0.05)；在4組細(xì)胞中，CD151-ARSA組(9.81±2.75)的細(xì)胞遷移能力最弱，與其他三組比較有顯著性差異(*P<0.05及[＃]P<0.05)(圖8)。說明CD151能夠促進(jìn)細(xì)胞的遷移，CD151-ARSA突變體使細(xì)胞遷移能力減弱。轉(zhuǎn)染病毒后HUVECs細(xì)胞中整合素a3b1/

8、a6b1表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，CD151組較其他三組有明顯增加(P<0.05)，CD151-ARSA組較CD151組明顯減少([＃]P<0.05)；而且在整合素內(nèi)化試驗(yàn)中，CD151組內(nèi)化的整合素b1較其他三組有明顯增加(P<0.05)，而CD151-ARSA組比Control組及GFP組明顯減少(*P<0.05)。
　　 結(jié)論：1. 成功構(gòu)建CD151-ARSA突變體并包裝成重組腺相關(guān)病毒，為進(jìn)一步研究CD151的功能和作用機(jī)

9、制奠定了基礎(chǔ)；
　　 2. CD151可以促進(jìn)HUVECs細(xì)胞的增殖與遷移，而CD151-ARSA突變體則減弱內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移能力；
　　 3. CD151能夠促進(jìn)整合素a3b1/a6b1在HUVECs細(xì)胞中的表達(dá)，而且能夠促進(jìn)整合素b1的內(nèi)化；而CD151-ARSA突變體不增加整合素a3b1/a6b1的表達(dá)，卻減少整合素b1的內(nèi)化；
　　 4.CD151可能是通過C末端囊泡運(yùn)輸基序YRSL245-248影響