內(nèi)皮抑制素相互作用蛋白的研究.pdf

1、該研究結(jié)合生物信息學(xué)、酵母雙雜交、細(xì)胞培養(yǎng)等方法,對(duì)與內(nèi)皮抑制素結(jié)合的侯選蛋白的特性進(jìn)行了初步分析,不僅有助于闡明其本身抑制血管生成作用的分子機(jī)制,還可為以抑制血管生成和相關(guān)抑制物為基礎(chǔ)的疾病防治提供新思路、新方法.研究結(jié)果可概述為以下幾個(gè)方面：1.構(gòu)建內(nèi)皮抑制素誘餌蛋白載體pGBKT7ENDO并轉(zhuǎn)化至酵母菌株AH109,對(duì)內(nèi)皮抑制素自身的轉(zhuǎn)錄激活活性進(jìn)行了分析,結(jié)果表明內(nèi)皮抑制素自身不具轉(zhuǎn)錄激活活性.Western-blot結(jié)果表明內(nèi)

2、皮抑制素能在AH109中表達(dá).2.利用酵母雙雜交系統(tǒng)系統(tǒng)3（CLONTECH）從人肝細(xì)胞預(yù)轉(zhuǎn)cDNA文庫(kù)篩選內(nèi)皮抑制素的相互作用蛋白,得到了4個(gè)與內(nèi)皮抑制素有特異相互作用的克隆.序列分析和同源檢索表明：它們分別為人肌球蛋白（myosin）、載脂蛋白H（apolipoproteinH)、hepsin（一種與膜締合的絲氨酸蛋白酶）和一未知蛋白HT036.3.利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交系統(tǒng)（Mammalian MATCHMAKER Tybrid

3、experiments）驗(yàn)證內(nèi)皮抑制素與人肌球蛋白、載脂蛋白H、hepsin和未知蛋白HT036間在哺乳動(dòng)物細(xì)胞水平的特異的相互作用.4.細(xì)胞免疫共沉淀（Co-IP）結(jié)果顯示在哺乳動(dòng)物細(xì)胞水平能檢測(cè)到內(nèi)皮抑制素與人未知蛋白HT036間特異的相互作用,進(jìn)一步確定了此相互作用的真實(shí)性和可靠性.5.利用圖形工作站,以1K77晶體結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)為依據(jù),結(jié)合氫原子及側(cè)鏈的影響,對(duì)人未知蛋白HT036的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了同源模建.6.將HT036克隆于