人肝再生增強(qiáng)因子相互作用蛋白的研究.pdf

1、目的：肝再生增強(qiáng)因子(augmenterofliverregeneration，ALR)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種促肝細(xì)胞再生的細(xì)胞因子。ALR的生物學(xué)作用主要表現(xiàn)在直接刺激肝細(xì)胞增殖和再生、對肝臟的保護(hù)作用、參與組織器官的形成與發(fā)育、免疫調(diào)控作用以及促肝癌細(xì)胞增殖等效應(yīng)。盡管有上述重要生物學(xué)作用，但ALR究竟如何發(fā)揮生物學(xué)作用目前仍知之較少。如果能獲得與ALR發(fā)生相互作用的蛋白，并且鑒定出ALR受體，將有助于深刻理解ALR的生物學(xué)功能，特別是

2、為深入了解ALR與肝癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。本實驗擬從人肝癌細(xì)胞的cDNA噬菌體表面展示文庫中篩選與人肝再生增強(qiáng)因子(humanaugmenterofliverregeneration，hALR)相互作用的特異噬菌體克隆，通過序列分析及生物學(xué)活性檢測確認(rèn)hALR相互作用蛋白，構(gòu)建原核表達(dá)載體，為進(jìn)一步鑒定ALR受體提供實驗基礎(chǔ)。 方法： 1．以hALR為靶蛋白，從人肝癌細(xì)胞cDNA噬菌體展示文庫中篩選與hALR相互作

3、用的特異噬菌體克隆；對獲得的特異噬菌體克隆cDNA插入片段進(jìn)行序列測序及生物信息學(xué)分析；利用3H-TdR摻入法測定hALR聯(lián)合陽性噬菌體展示肽及單獨陽性噬菌體展示肽對QGY肝癌細(xì)胞株的增殖效應(yīng)。 2．按照3’一RACE及5'-RACE試劑盒(TaKaRa)操作流程進(jìn)行hALR相互作用肽cDNA3’末端及5’末端快速擴(kuò)增，對擴(kuò)增序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 3．構(gòu)建hALR相互作用肽一pQE30原核表達(dá)載體，采用Tricine

4、—SDS—PAGE電泳觀察產(chǎn)物的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1．hALR相互作用蛋白的篩選 1．1噬菌體的富集效果： 人肝癌細(xì)胞cDNA噬菌體表面展示文庫經(jīng)過四輪篩選后，噬菌體的富集效果(產(chǎn)出／投入比)是第一輪的30多倍，表明特異的陽性克隆得到富集。 1．2PCR法鑒定篩選后cDNA插入片段： 第一輪篩選后的cDNA插入片段大小不等，在100-500bp之間，而經(jīng)過四輪篩選后隨機(jī)挑選的噬菌體克隆的

5、cDNA插入片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后都長約300bp，亦表明相近親和力的特異性噬菌體得到大量富集。 1.3cDNA插入片段的序列測定及生物信息學(xué)分析： 隨機(jī)挑選兩個陽性克隆PCR產(chǎn)物，測序證實為同一噬菌體重組子，cDNA插入片段為212bp，說明經(jīng)過以hALR為靶蛋白的篩選后，所得到的噬菌體都展示出一段相同的氨基酸序列，提示篩選出的噬菌體展示多肽很可能是與hALR發(fā)生特異性結(jié)合的部位。 將篩選得到的cDNA插入片段序列

6、在NCBI的GenBank中進(jìn)行同源序列比較(BLAST)，與人Citron激酶mRNA的部分序列同源性達(dá)100％，登錄號為AY257469。根據(jù)跨膜蛋白預(yù)測分析軟件TMBETA-Net分析該激酶N端有部分跨膜表達(dá)片段，我們篩選獲得的hALR相互作用肽部分氨基酸可能是Citron激酶的膜上片段。 1．4噬菌體展示肽的生物學(xué)功能： 將不同滴度四篩后噬菌體液與hALR混合后同時作用于QGY細(xì)胞，觀察到顯著促增殖效應(yīng)，且明顯高

7、于單獨的hALR組(F=29．28、p<0．01)；而混合hALR的不同對照噬菌體組與單獨的hALR組間比較無顯著性差異(F=0．638、p>0．05)，提示篩庫獲得的陽性噬菌體展示肽與hALR二者間有協(xié)同效應(yīng)。此外，單獨的陽性噬菌體展示肽對QGY細(xì)胞亦具有明顯促增殖作用，且呈滴度量依賴關(guān)系(F=67．88、p<0．01)，而不同滴度的對照噬菌體無明顯促增殖效應(yīng)(F=0．579、p>0．05)。2．RACE技術(shù)擴(kuò)增hALR相互作用肽cD

8、NA末端序列： 3'-RACE實驗擴(kuò)增出陽性對照產(chǎn)物，但未能擴(kuò)增出hALR相互作用肽cDNA3’端序列，5'-RACE實驗擴(kuò)增出487bp的序列，其中5’端延伸了275bp，序列同源性分析表明仍與人Citron激酶mRNA部分序列高度同源。RACE實驗進(jìn)一步確認(rèn)Citron激酶為hALR相互作用蛋白。 3．hALR相互作用肽一pQE30原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)： 成功構(gòu)建hALR相互作用肽～pQE30原核表達(dá)載體

9、，Tricine—SDS—PAGE電泳未觀察到目的多肽的表達(dá)。 結(jié)論： 1．特異性富集和分離出表達(dá)hALR相互作用蛋白的噬菌體克隆，并獲得相應(yīng)的核苷酸序列信息。 2．確認(rèn)Citron激酶為hALR相互作用蛋白，Citron激酶跨膜部分區(qū)域可能為hALR受體。 3．噬菌體展示hALR相互作用肽具有明顯的促肝癌細(xì)胞增殖的作用，為進(jìn)一步研究hALR受體的結(jié)構(gòu)和激活途徑提供了實驗基礎(chǔ)。 4．pQE30原核