MRG15蛋白與Sedlin蛋白的相互作用研究.pdf

1、目的：研究細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白MRG15(MORF4-Related Geneonchromosome15)與遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良蛋白Sedlin的相互作用。運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù),GSTpull-down技術(shù),免疫熒光技術(shù),免疫共沉淀的方法(co-immuno precipitation,CO-IP)檢測MRG15蛋白和Sedlin蛋白的相互作用。
　　方法：采用酵母雙雜交技術(shù)研究MRG15蛋白和Sedlin蛋白的相互作用,以人MRG

2、15全長cDNA為模板,PCR法擴(kuò)增人MRG15基因,將片段插入到pGADT7載體中,構(gòu)建pGADT7-MRG15載體。將其與pGBKT7-Sedlin共同轉(zhuǎn)化酵母菌AH109感受態(tài)細(xì)胞,SD(﹣Trp/﹣Leu/﹣His/+3-AT)X-α-gal培養(yǎng)基篩選藍(lán)色的陽性克隆。
　　采用GSTpull-down方法檢測MRG15蛋白和Sedlin蛋白在體外的相互作用。以人MRG15全長cDNA序列為模板,PCR擴(kuò)增目的基因并在N端加

3、FLAG標(biāo)簽,將帶有標(biāo)簽的MRG15基因構(gòu)建到pcDNA3.1載體上,構(gòu)建MRG15真核表達(dá)載體pcDNA3.1-FLAG-MRG15。將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FLAG-MRG15的293T細(xì)胞裂解液同GST和GST-Sedlin融合蛋白共同孵育2h,GST珠子經(jīng)洗滌沉淀后加SDS上樣緩沖液沸水浴,將裂解液和沉淀物經(jīng)SDS-PAGE電泳和免疫印跡后顯現(xiàn)條帶,用GST抗體和FLAG抗體分別印記。比較GST、GST-Sedlin和FLAG-

4、MRG15的相對位置,從而驗(yàn)證在體外MRG15蛋白和Sedlin蛋白的相互作用。
　　采用間接免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique)檢測MRG15蛋白和Sedlin蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的共定位情況。將pcDNA3.1-FLAG-MRG15和pcDGFP-Sedlin通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞中,先后孵育一抗、二抗,利用不同標(biāo)簽蛋白在不同激發(fā)光下顯示不同熒光,觀察MRG15蛋白和Sedlin蛋白

5、在COS7細(xì)胞中的定位。
　　采用免疫共沉淀的方法檢測哺乳細(xì)胞內(nèi)MRG15蛋白與Sedlin蛋白的結(jié)合情況。將pcDGFP-Sedlin和pcDNA3.1-FLAG-MRG15共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞,提取細(xì)胞裂解液,用FLAGM2單克隆抗體結(jié)合細(xì)胞裂解液中的MRG15及其結(jié)合蛋白進(jìn)行免疫共沉淀,通過Westernblot法檢測在MRG15蛋白與Sedlin蛋白的結(jié)合情況。
　　結(jié)果：酵母雙雜交結(jié)果表明,共表達(dá)MRG15

6、蛋白和Sedlin蛋白兩種融合蛋白,細(xì)胞表現(xiàn)α-半乳糖苷酶活性,SD培養(yǎng)基上長出藍(lán)色菌落,表明兩種蛋白能夠相互作用。GSTpull-down結(jié)果表明,MRG15和GST-Sedlin蛋白在體外能夠結(jié)合。免疫熒光結(jié)果表明了MRG15蛋白主要分布在細(xì)胞核,Sedlin蛋白在胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有分布,二者在細(xì)胞核內(nèi)有部分共定位。免疫共沉淀的結(jié)果表明,在HEK293T細(xì)胞中,MRG15和Sedlin能夠相互作用。
　　結(jié)論：以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明