與LIM蛋白FHL1C相互作用蛋白的檢測.pdf

1、目前，惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率在中國都呈增加趨勢，據(jù)統(tǒng)計(jì)資料顯示惡性腫瘤已成為中國城市居民死因的第一位。因此，惡性腫瘤的預(yù)防和治療已成為現(xiàn)階段研究的焦點(diǎn)。惡性腫瘤不僅生長迅速，而且能夠發(fā)生局部侵潤，遷移蔓延到身體的其他部位，這是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特點(diǎn)。它不僅是導(dǎo)致患者死亡的主要原因也是癌癥治療中的最大障礙，因此目前的研究主要集中在其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，以尋求治療癌癥的突破點(diǎn)。
　　EMT（Epithelial-Mesenchyma

2、l Transition，EMT）作為腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的重要參與者，使細(xì)胞之間的連接與腫瘤的發(fā)生產(chǎn)生了新的聯(lián)系。EMT過程中細(xì)胞間的緊密連接出現(xiàn)了功能障礙，細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附和細(xì)胞的極性喪失，細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)，這與腫瘤的轉(zhuǎn)移過程機(jī)制相同。EMT的發(fā)生涉及多種信號(hào)途徑的相互作用，其中Notch信號(hào)通路是誘導(dǎo)EMT發(fā)生的主要信號(hào)途徑之一。Notch∕RBP-Jk信號(hào)途徑是進(jìn)化上高度保守的一條信號(hào)通路途徑，通過介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間的相互作用

3、而與多種生理及病理過程密切相關(guān)，其異常活化與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。多項(xiàng)研究結(jié)果表明Notch信號(hào)途徑的活化可以促進(jìn)EMT過程的發(fā)生，而且下調(diào)Notch信號(hào)途徑則可引發(fā)相反的過程，并抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。RBP-Jk是Notch信號(hào)途徑中最主要的下游效應(yīng)物，Notch信號(hào)途徑的活化是依賴于RBP-Jk介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活下游基因而實(shí)現(xiàn)的。在對(duì)Notch信號(hào)途徑的研究中發(fā)現(xiàn)LIM結(jié)構(gòu)域蛋白KyoT2（鼠源）可以與R

4、BP-Jk相互作用形成復(fù)合物，進(jìn)而競爭性抑制RBP-Jk介導(dǎo)的Notch下游基因的轉(zhuǎn)錄，阻斷Notch的活化。
　　FHL1C，KyoT2人的同源物，是FHL1蛋白的一種亞型，屬于LIM蛋白家族中的LIM-only蛋白。它包含氨基端的兩個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域和和羧基端的RBP-Jk結(jié)合位點(diǎn)。含有LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白不僅在不同的細(xì)胞進(jìn)程中具有重要的作用，比如細(xì)胞骨架組織，信號(hào)傳導(dǎo)，基因表達(dá)和細(xì)胞分化等，而且是一個(gè)蛋白間相互作用的基序。這種相

5、互作用能夠顯示不同的功能，從而在細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的維持以及信號(hào)通路等中發(fā)揮作用。研究組前期通過在對(duì)KyoT2抑制RBP-Jk介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制的深入研究過程中，以KyoT2為誘餌蛋白通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)得到了人類緊密連接蛋白ZO-2，并初步驗(yàn)證了KyoT2與 ZO-2的相互作用位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)首先通過哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 ZO-2與KyoT2在體內(nèi)的是否有相互作用，后又以FHL1C為目的蛋白通過免疫沉淀實(shí)驗(yàn)在FHL1C和RBP-Jk共轉(zhuǎn)組中拉下了人

6、類緊密連接蛋白ZO-1。ZO-1和ZO-2屬同一蛋白家族，在上皮和內(nèi)皮細(xì)胞間的連接中具有重要的作用。并且在EMT發(fā)生的過程中，ZO-1和ZO-2都為重要的參與者，但是它們參與的過程是通過何種機(jī)制發(fā)生的，目前尚不清楚。因此基于以上研究結(jié)果分析，通過與FHL1C（鼠源的KyoT2）相互作用蛋白的檢測結(jié)果，推測ZO-1可能通過Notch信號(hào)途徑而參與EMT的發(fā)生過程。目前，共進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)。
　　主要研究結(jié)果：
　　1.分三段成功

7、克隆了小鼠緊密連接蛋白ZO-2開放讀碼框全長基因，并將其連入哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)質(zhì)粒pCMX-VP16中，分別構(gòu)建了分段和全長的pCMX-VP16-F1R1,pCMX-VP16-F2R2,pCMX-VP16F3R3和pCMX-VP16-ZO的真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　2.為了證實(shí)KyoT2和緊密連接蛋白ZO-2之間在體內(nèi)是否存在相互作用及確定其作用位點(diǎn)，在Cos7細(xì)胞系中進(jìn)行了KyoT2與ZO-2之間分段以及全長的哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果

8、分析表明它們未能激活下游的報(bào)告基因的活性，即KyoT2和ZO-2在體內(nèi)可能沒有相互作用關(guān)系。
　　通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，原因可能為：1.酵母雙雜交試驗(yàn)有一定的假陽性結(jié)果。2.在體外通過GST-pull-down驗(yàn)證的蛋白質(zhì)之間的相互作用在體內(nèi)不一定有作用。但是LIM結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)間相互作用的界面，我們設(shè)想KyoT2在通過其RBP-Jk結(jié)合位點(diǎn)競爭性抑制NIC的轉(zhuǎn)錄激活作用外，還可能通過其LIM結(jié)構(gòu)域向RBP-Jk募集其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子。

9、因此想要通過FHL1C進(jìn)一步尋找與其相互作用的新蛋白以期更明確的闡明阻斷Notch信號(hào)途徑的作用機(jī)理并為設(shè)計(jì)優(yōu)化新型的Notch信號(hào)阻斷劑奠定理論基礎(chǔ)。因此接下來又進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：
　　主要研究成果
　　1.通過在293T細(xì)胞系中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pCMV-myc-FHL1C48小時(shí)后，用Western-blot成功檢測到帶myc標(biāo)簽的過表達(dá)蛋白FHL1C。
　　2.通過免疫沉淀，銀染色確定有相互作用的新蛋白，并在質(zhì)

10、譜分析結(jié)果中在FHL1C和RBP-Jk共轉(zhuǎn)組中成功發(fā)現(xiàn)了拉下的新的相互作用蛋白人類緊密連接蛋白ZO-1。
　　綜合以上結(jié)果分析，ZO-1和ZO-2同屬于緊密連接蛋白家族，且ZO-1和ZO-2之間通過相互結(jié)合共同定位在上皮細(xì)胞的緊密連接處的質(zhì)膜內(nèi)，并且已有研究表明ZO-1和ZO-2都為上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 EMT（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）發(fā)生的相關(guān)分子，ZO-1從質(zhì)膜向胞質(zhì)的異位和功能失