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文檔簡介
1、一、研究背景 各種損傷特別是大面積燒傷導致皮膚缺損的治療,是盡快封閉創(chuàng)面,由于自體皮源的不足,常導致治療的失敗。組織工程化皮膚研究一直是當前研究的熱點,目前尚無特別有效的皮膚替代物應用于臨床。而表皮干細胞(keratinocytestemcell,KSC)具有強大的增殖能力,又可向各個階段表皮細胞分化以維持皮膚新陳代謝,因此KSC作為皮膚重建的“種子細胞”成為研究的熱點。如何在體外培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量的KSC用于研究及移植,如何在體
2、內(nèi)外誘導KSC定向分化,對于組織工程皮膚具有重要意義。解決這些問題的關(guān)鍵在于研究KSC增殖與分化的調(diào)控機制。 整合素β1是KSC未分化的分子標記之一,Jones等發(fā)現(xiàn)高表達整合素β1的表皮細胞具有更高的克隆形成能力,傳代次數(shù)顯著多于低表達的細胞。本室前期通過構(gòu)建整合素β1小RNA干擾載體,轉(zhuǎn)染KSC,發(fā)現(xiàn)下調(diào)表達整合素β1蛋白,實驗組克隆形成率比對照組降低,促進KSC的分化。提示整合素β1參與KSC的增殖分化的調(diào)控。目前雖然對整
3、合素β1參與KSC增殖與分化的調(diào)控研究比較多,但是整合素β1的表達調(diào)控的機制尚不清楚。 體外實驗研究中,KSC通常從不同的個體分離和純化,存在個體差異和不穩(wěn)定性,因此尋找一種穩(wěn)定細胞模型對KSC進行分化與增殖調(diào)控機制的研究具有重要意義。HaCaT是來源于正常成人上皮細胞的表皮細胞株,具有無限的增殖能力。研究表明,將HaCaT移植到裸鼠上,HaCaT可以形成分化上皮組織,表達特異性分化蛋白標志,因此HaCaT可以為研究人表皮細胞分
4、化的調(diào)控提供一個非常理想的模型。研究擬應用整合素β1啟動子熒光素酶報告基因系統(tǒng),以HaCaT細胞為模型,探討表皮細胞中整合素β1對增殖分化的影響,以及整合素β1的表達調(diào)節(jié)機制,為進一步研究表皮干細胞的增殖分化機制奠定基礎。 二、研究目的 1、下調(diào)人表皮細胞株HaCaT整合素β1,觀察其增殖的情況。 2、研究整合素β1啟動子在HaCaT中的活性,為研究干細胞分化與增殖調(diào)控機制提供理論基礎。 三、研究方法
5、 應用本室前期構(gòu)建好的整合素β1小RNA干擾載體轉(zhuǎn)染HaCaT,通過瞬時轉(zhuǎn)染,用Westernblot檢測轉(zhuǎn)染后HaCaT整合素β1蛋白的改變;通過潮霉素持續(xù)加壓篩選轉(zhuǎn)染細胞,直到轉(zhuǎn)染細胞株單克隆形成,擴大培養(yǎng),通過計數(shù)法描述其生長曲線。 構(gòu)建和鑒定整合素β1遠端和近端啟動子雙熒光素酶報告載體,轉(zhuǎn)染HaCaT細胞,比較整合素β1遠端與近端啟動子在HaCaT中的活性,確定其在HaCaT中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的的作用。 四、研究
6、結(jié)果 整合素β1小干擾RNA載體轉(zhuǎn)染HaCaT能夠抑制整合素β1蛋白的表達,生長曲線右移,HaCaT的增殖受到抑制。 成功的從人基因組擴增了整合素β1啟動子全長,并將整合素β1的遠端與近端啟動子構(gòu)建到熒光素酶報告基因載體。將整合素β1遠端與近端啟動子轉(zhuǎn)染HaCaT,熒光素酶活性分析表明,遠端啟動子在整合素β1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起主要作用。 五、研究結(jié)論 整合素β1參與表皮細胞株HaCaT的增殖分化調(diào)節(jié),整合素β1
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