整合素β1在細胞因子誘導的破骨細胞分化中的作用及其機制.pdf

1、骨組織的變化在很大程度上是由兩種骨細胞聯(lián)合作用的，即成骨細胞和破骨細胞。成骨細胞是主要負責新骨形成，而破骨細胞則負責清除骨化組織。他們的形成和活動受到多種激素和細胞因子的嚴格控制。干擾這些細胞能形成許多病理骨狀況。特別是在成人骨骼疾病中，如骨關節(jié)炎，類風濕性關節(jié)炎，破骨細胞活動異常。促炎分泌物如TNF-α、IL-6產(chǎn)生于病理骨組織中，并逐漸調(diào)節(jié)破骨細胞活動，促進疾病發(fā)展，因此靶向抑制這些促炎癥分泌物的對于疾病的治療至關重要。最近的研究進

2、展顯示了腫瘤壞死因子受體(TNFR)/TNF樣蛋白質(zhì)的重要性:骨保護素(OPG)，核因子激活受體(RANK)和RANK配體(RANKL)共同調(diào)控破骨細胞功能。目前的研究表明RANKL或TNF-α聯(lián)合巨噬細胞集落刺激因子(MCSF)能從骨髓巨噬細胞體外引起破骨細胞生成，但機制不完全清楚。所以，進一步闡明RANKL或TNF-α信號通路生理和病理的調(diào)整，對于骨溶解的臨床干預治療具有重要的意義。
　　整合蛋白是介導細胞和細胞及細胞和基質(zhì)間

3、相互作用的異二聚體受體，他們在破骨細胞分化和活化中起到重要作用。破骨細胞的表達的整合蛋白經(jīng)分析確定至少有三種主要的集成類型——α5β3，α5β1，α2β1。盡管α5β3整合蛋白在破骨細胞生成中有至關重要的作用，其他的類型仍然未知。但考慮到大部分都涉及到整合蛋白β1，通過整合蛋白β1可以分析其他亞類型和整合蛋白β1參與破骨細胞分化的作用。
　　α腫瘤壞死因子（TNF-α）是一種主要由巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生的促炎細胞因子，并參與正常炎

4、癥反應和免疫反應。α腫瘤壞死因子在許多病理狀態(tài)下產(chǎn)生增多，包括敗血癥、惡性腫瘤、心臟衰竭和慢性炎性疾病。在重癥類風濕關節(jié)炎患者的血液及關節(jié)中都可發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子增多。在本研究中TNF-α具有誘導破骨細胞分化的重要作用。而研究中另外一種具有誘導破骨細胞分化的重要作用的因子為RANKL，RANKL全稱為Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand（核因子κB受體活化因子配體），又名為TNF-

5、related activation-induced cytokine(TRANCE)，TNF相關激活誘導細胞因子;osteoprotegerin ligand(OPGL)，骨保護素配體osteoclast differentiation factor(ODF)，破骨細胞分化因子。為避免不同命名在學術上引起不便，美國骨礦研究學會(ASBMR)將其標準化命名為RANKL。其在成骨細胞中表達(osteoblast)，激活破骨細胞。RANKL

6、過表達，可導致一系列骨疾病，如風濕性關節(jié)炎，銀屑病性關節(jié)炎等相關疾病。
　　雖然RANKL和TNFα誘導破骨細胞分化的作用是已知的，但是其具體的作用機制還不完全清楚，尤其是TNFα的機制，報道很少。TNFα誘導破骨細胞生成的下游信號傳導通路沒有一致的研究結論。然而，我們越來越多的證據(jù)證實了在TNFα作用時和整合素β1作用密切相關。
　　因此，本項目擬研究整合素β1在細胞因子誘導的破骨細胞分化中的作用及其機制。我們首先構建了整

7、合素β1沉默表達細胞系，用RNA干擾技術進行整合素β1的基因敲除，成功構建了所需要的細胞系。然后通過這種細胞系，探索整合素β1是對破骨細胞分化是否具有作用。我們用兩種誘導劑誘導破骨細胞分化，分別為RANKL和TNF-α。在兩種誘導劑處理組中，結果明顯不同。在TNF-α誘導破骨細胞生成中，穩(wěn)定的敲除整合素β1后，TRAP陽性破骨細胞數(shù)量明顯減少，而RANKL處理組中，TRAP陽性破骨細胞數(shù)量沒有顯著變化。為了進一步驗證結果，我們做了破骨細

8、胞陷窩形成實驗，實驗結果和TRAP陽性檢測結果類似，TNF-α誘導后，整合素β1敲除組陷窩形成顯著下降，RANKL處理后，未見顯著變換。最后，我們對破骨細胞分化的標志性基因Cathespinκ和Osterix進行檢測，結果顯示，同樣的，在TNF-α誘導后，整合素β1敲除組中Cathespinκ和Osterix的表達都顯著降低，而RANKL處理后，兩種基因的表達未發(fā)現(xiàn)顯著變化。以上結果表明，在TNF-α誘導破骨細胞分化的過程中，整合素β1

9、起著重要的作用，它可以促進這一分化過程，而在RANKL誘導破骨細胞分化的過程中，整合素β1則沒有這一作用。
　　為了闡明整合素β1在破骨細胞分化中的分子機制，我們進一步研究與破骨細胞分化有關的信號通路的變化，我們選擇了三種信號通路，NF-κB信號通路、MAPK信號通路、JNK信號通路。分別應用RANKL，TNF-α作用于細胞，檢測兩種因子作用下對照組與整合素β1敲除組之間NF-κB、MAPK以及JNK三種信號通路中關鍵因子的變化。

10、在TNF-α作用的反應中，整合素β1敲除組MAPK信號通路關鍵因子p38激酶磷酸化明顯減少，而NF-KB和JNK信號通路中的關鍵因子均沒有顯著變化。相比之下，在RANKL作用下，對照組和整合素β1敲除組NF-κB、MAPK以及JNK三種信號通路中各關鍵因子均沒有發(fā)生顯著變化。這一結果提示我們，在TNF-α誘導的破骨細胞分化中，整合素β1的作用可能與MAPK信號通路有一定關系。為了進一步驗證我們的實驗結論，我們用MAPK抑制劑作用于β1敲

11、除組細胞，仍然分別用RANKL和TNF-α進行誘導處理，結果發(fā)現(xiàn)，抑制MAKP后，只在TNF-α處理的β1敲除組中觀察到破骨細胞分化顯著降低。令人驚訝的是，盡管在RANKL處理中我們也增加了MAPK抑制劑，但是沒有顯示破骨細胞分化顯著減少。通過推測，這意味著與TNF-α誘導破骨細胞的形成相比，MAPK信號通路在RANKL誘導的破骨細胞中的作用很小。而以上結果也進一步證實了，在TNF-α誘導的破骨細胞分化中，整合素β1的作用與MAPK信號

12、通路有關。
　　最后，我們又應用了整合素β1抑制劑進行作用，分為空白對照組，2.5μg/mL組和5.0μg/mL組，結果顯示，在RANKL處理中，破骨細胞分化數(shù)量沒有顯著變化，而在TNF-α處理時，整合素β1抑制劑組破骨細胞分化數(shù)量顯著下降，而且5.0μg/mL組比2.5μg/mL組破骨細胞數(shù)量下降更加顯著。這一結果進一步證明了整合素β1在TNF-α誘導的破骨細胞分化過程中起著重要的促進作用，而且提示我們這種促進作用和整合素β1的

13、含量呈現(xiàn)一個正相關。同樣，我們用MAPK激酶抑制劑做相同的實驗，結果整合素β1抑制劑實驗結果類似，在RANKL處理中，破骨細胞分化數(shù)量沒有顯著變化，而在TNF-α處理時，整合素β1抑制劑組破骨細胞分化數(shù)量顯著下降，而且5.0μg/mL組比2.5μg/mL組破骨細胞數(shù)量下降更加顯著。這也進一步說明了MAPK信號通路在TNF-α在誘導破骨細胞分化的過程中起著重要作用，抑制此通路可以減少破骨細胞分化。
　　總之，我們的研究結果表明，整合