TRPV5在維生素D調(diào)控破骨細(xì)胞分化和骨吸收中的作用.pdf

1、骨骼是一種不斷更新的動態(tài)器官。破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)和成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)是分別負(fù)責(zé)骨吸收和骨重建的功能細(xì)胞，骨更新動態(tài)平衡的破壞會引起一系列的骨代謝異常性疾病，如骨質(zhì)疏松、骨硬化癥等。維生素D是一種類固醇類激素，1α，25-(OH)2D3是維生素D在體內(nèi)的最強(qiáng)活化形式，參與骨代謝的調(diào)節(jié)，在維持機(jī)體內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)中有著重要作用。TRPV5是一種發(fā)現(xiàn)于腎小管的，對Ca2+具有高敏感性的通道蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，缺

2、少TRPV5通道，將影響OC的分化及骨吸收功能，但對于其作用機(jī)制目前還不清楚。本文研究了TRPV5在小鼠單核細(xì)胞分化為OC過程中的作用和機(jī)制，以及在維生素D調(diào)控OC分化過程中的作用。為進(jìn)一步闡明OC相關(guān)的骨吸收活動調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論依據(jù)，研究內(nèi)容如下:
　　1.細(xì)胞接種密度對維生素D調(diào)控OC分化的影響
　　為了研究單核細(xì)胞不同接種密度對OC分化能力的影響，從4至5周齡BALB/c小鼠骨髓腔分離得到骨髓單核細(xì)胞，以0.3、0.7

3、、1.5、3、6、12、24、48×104/孔(0.94、2.18、4.68、9.37、18.75、37.5、75、150×104/cm2)的密度接種于96孔板。用含50 nmol/LM-CSF和30 nmol/L RANKL的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)3d，更換培養(yǎng)液為含30 nmol/L M-CSF、50 nmol/L RANKL及10 nmol/L1，25(OH)2D3的α-MEM，培養(yǎng)2d后TRAP染色鑒定OC，免疫熒光檢測OC中VD

4、R表達(dá)水平。結(jié)果顯示，隨著單核細(xì)胞接種密度的升高，OC生成數(shù)量增加，呈上升趨勢;但OC的生成率與細(xì)胞接種密度呈負(fù)相關(guān)，接種濃度越高，則OC的生成率越低，呈下降趨勢。VDR在單核細(xì)胞、未成熟的OC以及成熟OC中均有分布。不同接種密度的單核細(xì)胞，維生素D對其分化為OC的影響不同。當(dāng)細(xì)胞接種密度為18.75、37.75、75×104/cm2時，與空白組相比維生素D可以顯著抑制OC的生成;而接種濃度為0.93、2.18×104/cm2時，維生素

5、D可以顯著促進(jìn)OC的生成。
　　2.TRPV5在OC分化及骨吸收中的作用
　　為了探討TRPV5在OC分化及骨吸收過程中的作用，本實驗采用RuR作為TRPV5通道阻滯劑，研究不同濃度RuR(0、10、50、100、500、1000 nmol/L)對OC分化以及活性的影響。同時，RuR在不同濃度和時間下(1、2、3d)作用OC，western-blot檢測OC中TRPV5以及骨吸收活性相關(guān)蛋白V-ATPase、CTSK、TRA

6、P、CaⅡ表達(dá)水平。結(jié)果表明，0、10、50、100、500以及1000 nmol/L RuR對OC活性沒有顯著影響，但是各濃度的RuR均顯著抑制OC的分化能力。不同濃度(10、100、1000nmol/L) RuR在不同時間(1、2、3d)均顯著抑制TRPV5的表達(dá)，同時骨吸收活性相關(guān)蛋白V-ATPase、CTSK、TRAP以及CaⅡ的表達(dá)量也出現(xiàn)一定程度下降，并且NFAT1的表達(dá)水平呈現(xiàn)一定程度的抑制。
　　3.TRPV5在維

7、生素D調(diào)控OC中的作用
　　為了研究TRPV5在維生素D調(diào)控OC分化及骨吸收過程中的作用，在不同濃度、時間下通過維生素D作用OC，檢測維生素D對TRPV5表達(dá)水平的影響。在第3、5、7d添加維生素D、維生素D+TRPV5阻滯劑(RuR/ECO)、TRPV5阻滯劑(RuR/ECO加處理，每次處理時間為2d，于第9 d TRAP染色并計數(shù)OC。同時，利用western-blot檢測骨吸收標(biāo)志蛋白V-ATPase、CTSK、TRAP、C

8、aⅡ以及OC轉(zhuǎn)錄因子NFATc1在該條件下的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，維生素D僅在處理1d和2d時抑制TRPV5的表達(dá)水平。也僅在2d時維生素D顯著抑制OC分化，同時，添加維生素D+TRPV5阻滯劑可持續(xù)抑制OC的分化，但維生素D組與維生素D+TRPV5阻滯劑組OC分化水平并沒有顯著差異性。維生素D+TRPV5阻滯劑組與維生素D組相比顯著抑制了骨吸收標(biāo)志蛋白V-ATPase、CTSK、TRAP、CaⅡ的表達(dá)，但是對NFATc1的表達(dá)水平并沒有