辛伐他汀、甲狀旁腺素相關(guān)肽（PTHrP）在破骨細(xì)胞生成和骨吸收中的作用.pdf

1、辛近來研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可有效地治療骨質(zhì)疏松，降低骨折的發(fā)病率[1,2]。究其機(jī)理，多認(rèn)為他汀類藥物可以促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，但對破骨細(xì)胞的作用目前卻很少報(bào)道。 多種骨吸收性疾病，包括骨質(zhì)疏松、炎癥性骨病、骨轉(zhuǎn)移癌、牙周疾病等，無論其致病原因如何，最終都是通過破骨細(xì)胞功能加強(qiáng)，破骨活動強(qiáng)于成骨活動而導(dǎo)致的。成骨細(xì)胞/骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面的RANKL基因(receptoractivatorofNF-κBLigand，核激

2、活因子受體配體)，是破骨細(xì)胞分化和發(fā)揮功能的關(guān)鍵基因。RANKL與破骨細(xì)胞表面的RANK(receptoractivatorofNF-κB，核激活因子受體)結(jié)合后，刺激破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成熟破骨細(xì)胞分化，也刺激了成熟破骨細(xì)胞發(fā)揮骨吸收功能。骨保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG)是RANKL的假目標(biāo)受體，可以拮抗RANKL的作用。 在骨轉(zhuǎn)移癌中，腫瘤細(xì)胞分泌的甲狀旁腺素相關(guān)肽(Parathyroidhormone-re

3、latedpeptide，PTHrP)，通過刺激成骨細(xì)胞/骨髓基質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)RANKL基因，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，加強(qiáng)破骨細(xì)胞的破骨活動，從而導(dǎo)致骨破壞。 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯浚盒练ニ∈欠衲芤种芇THrP誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成，以及其對骨髓基質(zhì)細(xì)胞中RANKL及OPG的基因表達(dá)有無影響。本文從體外細(xì)胞培養(yǎng)，體內(nèi)骨吸收模型建立等幾個(gè)方面，進(jìn)行研究，其主要內(nèi)容是： 一.辛伐他汀對PTHrP誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的影響PTHrP可以刺激骨髓

4、細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。鼠骨髓細(xì)胞在PTHrP的刺激下培養(yǎng)6d，可觀察到大量抗酒石酸染色陽性的破骨細(xì)胞生成。加入不同劑量的辛伐他汀培養(yǎng)6d后，通過對抗酒石酸染色陽性的破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)0.1μM的辛伐他汀就可以抑制破骨細(xì)胞的生成，10μM的辛伐他汀幾乎完全抑制了破骨細(xì)胞的生成。 二.辛伐他汀對貼壁骨髓基質(zhì)細(xì)胞中OPG/RANKL基因表達(dá)的影響收集骨髓細(xì)胞培養(yǎng)10d，每2-3d換液時(shí)輕輕吹打移去不貼壁的造血細(xì)胞，貼壁的骨髓細(xì)胞為骨

5、髓基質(zhì)細(xì)胞。傳代2次后，分組用不同濃度的辛伐他汀進(jìn)行干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)至貼壁細(xì)胞80％融合(3d)。提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測OPG和RANKL基因的表達(dá)。骨髓基質(zhì)細(xì)胞在辛伐他汀干預(yù)下，OPG基因表達(dá)明顯上調(diào)，RANKL基因的表達(dá)明顯下調(diào)，提示辛伐他汀參與骨髓基質(zhì)細(xì)胞中OPG和RANKL基因的調(diào)控。 三.辛伐他汀對體外小鼠顱骨骨代謝的影響收集骨髓基質(zhì)細(xì)胞分別在含有PTHrP或PTHrP+1.0μM辛伐他汀

6、的培養(yǎng)液中，在放有小鼠顱蓋骨的24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)8d。檢測培養(yǎng)上清堿性磷酸酶(ALP)和鈣離子含量的變化，觀察小鼠顱蓋骨組織學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：辛伐他汀體外可降低培養(yǎng)液中鈣離子的濃度，提高堿性磷酸酶的活性，并使小鼠顱蓋骨骨吸收抑制和礦化增強(qiáng)。 四.PTHrP誘導(dǎo)的局部骨吸收動物模型的建立每天皮下注射PTHrP1次，每次10μg到小鼠的左側(cè)頭皮下，分別在3d后的8h、12h、24h以及5d后的12h取材；每天皮下注射PTHrP2

7、次，注射5d后，12h取材。進(jìn)行X線片和組織學(xué)觀察，在顱骨部位，均產(chǎn)生了不同程度的骨吸收。每天注射1次，在注射PTHrP3d后的8h和12h，骨吸收不是很明顯，至24h骨吸收明顯，在注射5d后，骨吸收顯著；每天注射2次，5d后骨吸收最為顯著。在注射PTHrP1d后的3h，3d后的3h、6h和10h，5d后的3h和10h，分別檢測全血中血鈣變化，發(fā)現(xiàn)：注射PTHrP1d后，血鈣無變化；3d后血鈣顯著升高，維持3-6h后，在10h時(shí)，呈下降

8、趨勢；在注射PTHrP5d后的3h有明顯的高鈣血癥，在10h后逐漸下降。這提示PTHrP誘導(dǎo)的高鈣血癥水平并不恒定，而呈波動性變化。然而，每天注射2次，則在3d和5d后的10h血鈣水平下降較輕。局部骨吸收在注射3d后的24h比較明顯，在注射PTHrP5d后，可以建立穩(wěn)定可靠的局部骨吸收和高鈣血癥動物模型。 五.辛伐他汀對PTHrP體內(nèi)誘導(dǎo)的骨吸收和高鈣血癥的影響，利用注射PTHrP到小鼠顱骨建立的局部骨吸收動物模型，研究在動物體

9、內(nèi)辛伐他汀是否能抑制破骨細(xì)胞活動增強(qiáng)所導(dǎo)致的骨吸收。 BALB/C小鼠每天皮下注射PTHrP2次，每次10μg/10μl，共注射5天。并于前1天，開始對實(shí)驗(yàn)小鼠用辛伐他汀每天灌胃一次，分30、120mg/kg兩個(gè)治療組和空白對照組，7d后取材，進(jìn)行X線片測量骨吸收面積，組織學(xué)檢查計(jì)算單位面積內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)目，與對照組比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30mg/kg/d組和對照組比較并無差別；120mg/kg/d組骨吸收面積和單位面積內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)目均

10、顯著高于對照組。對血鈣水平的影響也只有在120mg/kg/d組有顯著下降。 說明辛伐他汀對小鼠局部骨吸收和高鈣血癥的抑制作用，只有達(dá)到一定的劑量才能出現(xiàn)。結(jié)果提示在體內(nèi)，大劑量的辛伐他汀可以抑制PTHrP誘導(dǎo)的骨吸收，并能有效地抑制高鈣血癥。 六.辛伐他汀對去勢大鼠骨質(zhì)疏松的預(yù)防性治療去勢大鼠每天辛伐他汀灌胃一次，每次10mg/kg，治療12周，檢測股骨骨密度、股骨生物力學(xué)和骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)，分別與去勢組和正常組比較。結(jié)

11、果發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀給藥組較去勢組各種參數(shù)均顯著改善，但與正常組比較，仍未達(dá)到正常水平。說明辛伐他汀能有效地減輕去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。 七.辛伐他汀對小鼠股骨干骨折愈合的影響的初步研究建立小鼠股骨干中段骨折的動物模型，分別于術(shù)后第1、8、14d開始給藥，用辛伐他汀每天灌胃一次，每次120mg/kg，并分別于0、8、14和22d照X線片，22d處死取材觀察組織學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：辛伐他汀在第0、8d開始給藥，對小鼠股骨干骨折愈合有著