甲狀旁腺素羧基端肽段的表達及其對大鼠成骨細胞增殖的影響.pdf

1、天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文甲狀旁腺素羧基端肽段的表達及其對大鼠成骨細胞增殖的影響姓名：李敬華申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：郭剛20100501天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文進行濃度為15％的SDSPAGE，觀察多肽表達情況；表達產(chǎn)物電泳凝膠對硝酸纖維素濾膜恒壓轉(zhuǎn)膜，山羊抗人PTH羧基端多克隆抗體進行WesternBlot鑒定，Xray曝光觀察顯影情況。5表達多肽的分離純化與濃度測定大量表達產(chǎn)物的碎菌上清進行Ni2_IDA

2、金屬螯合親和層析，收集洗脫液，BCA法測定純化后總蛋白濃度，采用ChemiGenius凝膠成像分析系統(tǒng)分析目的多肽的純度，計算多肽濃度。6PTH各種多肽片段對大鼠成骨細胞增殖的影響復(fù)蘇凍存的大鼠成骨細胞，傳代并接種于96孔板，待培養(yǎng)至細胞處于亞融合狀態(tài)后分別加入不同濃度rhPTHl臥rhPTHl34、rhPTH784及rhPTH3784。作用24小時，MTT法檢測570nm吸光度值，觀察細胞增殖情況。結(jié)果1PCR擴增結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)15

3、％瓊脂糖凝膠電泳，獲得了約270bp、250bp及160bp的清晰條帶，與預(yù)期一致。2重組表達質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定重組表達質(zhì)粒pQE一30XafPTHl84、pQE一30Xa／PTH784及pQE30XaJPTH3784經(jīng)PCR初步鑒定，瓊脂糖凝膠可見相應(yīng)大dxDNA片段；經(jīng)Sall和腳玎dIII雙酶切，得到約3500bp的pQE30Xa線性片段和約270bp、250bp及160bp含目的基因的重組片段；酶切陽性質(zhì)粒DNA測序分析與預(yù)

4、期完全一致。3表達產(chǎn)物的SDS—PAGE及WesternBlot鑒定誘導(dǎo)表達產(chǎn)物進行SDSPAGE鑒定，考馬斯亮藍R250染色可見碎菌上清液中存在分子量與預(yù)期大小相符的蛋白條帶；以抗人PTH羧基端多克隆抗體進行鑒定，顯示有明顯的蛋白質(zhì)印跡帶，證實條帶為含有PTH羧基端肽段的多肽。4表達產(chǎn)物BCA濃度測定及純度鑒定IPTG優(yōu)化誘導(dǎo)表達后，產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析法純化，BCA法蛋白濃度測定及凝膠成像分析后計算rhPTHl84、rhPTH784