靜磁場對大鼠成骨細胞及其牙周炎組織影響的研究.pdf

1、目的: 隨著生物磁技術的迅猛發(fā)展，磁治療在醫(yī)學中的基礎和臨床應用研究越來越受到關注，但是有關靜磁場對牙周炎組織生物效應的研究未見報道。 成骨細胞是保持骨形態(tài)結構和性能的最小結構和功能單位，作為骨組織的重要功能細胞，在骨的形成過程中起著關鍵作用。成骨細胞的增殖、骨基質的分泌和鈣鹽沉積對骨的形成、重建和修復具有重要意義。 該實驗通過建立體外培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細胞實驗模型，排除了體內復雜的生物環(huán)境因素的影響，觀察不同劑量

2、的靜磁場對體外培養(yǎng)的成骨細胞生長的直接效應，專一的分析研究靜磁場刺激對成骨細胞的生長和功能變化的影響；建立牙周炎動物實驗模型，研究靜磁場對牙周膜組織結構、功能的影響。從細胞水平和分子水平探討靜磁場對骨生長的作用機制，為臨床選擇合適的磁場參數(shù)，科學的利用磁場療法，提供實驗依據(jù)。 方法: 1.靜磁場的設計將釹鐵硼永磁體充磁后固定于特制的長方形槽內，其上方可以放置各種細胞培養(yǎng)板，調節(jié)槽裝置的高度，使培養(yǎng)板底部的磁場強度分別為0

3、Gs、400Gs、620Gs、830Gs、1080Gs。 2.大鼠顱骨成骨細胞的分離、培養(yǎng)無菌操作下取出Wistar乳鼠頭蓋骨，刮去骨膜和軟組織，經(jīng)0.25％胰酶和1mg/mlⅡ型膠原酶消化后，應用差速黏附法分離成纖維細胞，置于37℃、5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天換液，待細胞長滿平底后傳代，備用。 3.成骨細胞的增殖活性測定成骨細胞接種于96孔培養(yǎng)板內培養(yǎng)24h，將各培養(yǎng)板分別放入不同強度磁場中，繼續(xù)培養(yǎng)24h

4、、48h、72h。在每時間點應用MTT法，測定490nm的OD值。實驗重復2次。 4.流式細胞儀測定成骨細胞周期細胞接種于35mm直徑的培養(yǎng)皿內培養(yǎng)72h，將各培養(yǎng)皿分別放人磁場強度為0Gs、620Gs、1080Gs的磁場中，繼續(xù)培養(yǎng)48h。0.25％胰酶消化，加入PI染液，流式細胞儀檢測細胞DNA周期。實驗重復3次。 5.成骨細胞ALP染色及活性測定傳代成骨細胞接種于蓋玻片上培養(yǎng)48h，并于620Gs磁場環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)

5、細胞48h。采用改良鈣鈷法進行ALP酶染色。 成骨細胞接種于96孔培養(yǎng)板內培養(yǎng)，并施加不同強度的磁場處理24h、48h、72h。經(jīng)0.2％TritonX-100液作用后，加入pNPP液，酶聯(lián)免疫檢測儀上測定405nm的OD值。 6.成骨細胞的Ⅰ型膠原免疫組化染色及Western印記分析傳代成骨細胞接種于蓋玻片上培養(yǎng)72h，并于620Gs磁場環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)細胞48h。取出蓋玻片，丙酮固定，采用SABC法進行Ⅰ型膠原免疫組化

6、染色。 細胞接種于35mm直徑的培養(yǎng)皿內培養(yǎng)72h，放人磁場強度為620Gs的磁場中繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h。收集并裂解細胞，應用Western印記法測定Ⅰ型膠原。 7.成骨細胞體外鈣化檢測將細胞以5×104/ml分別接種于24孔培養(yǎng)板的兩側，培養(yǎng)24h后，將其中一側加620Gs磁場，定期換液，培養(yǎng)2周。倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)和骨結節(jié)的數(shù)量。 8.動物實驗 8.1 牙周炎動物模型制備應用不銹鋼絲

7、結扎法制備Wistar大鼠牙周炎動物模型。5周后去除結扎絲，在大鼠頭部頰部區(qū)切開皮膚，將充磁和未充磁的釹鐵硼永磁體分別埋人皮下組織中，于實驗后第2、4、7天處死大鼠。切取病灶牙及其周圍牙周組織制備標本。 8.2 行HE染色，光鏡下觀察牙周膜組織結構，電子顯微鏡下觀察超微結構變化 8.3 BMP-2的免疫組織化學染色和原位雜交檢測組織切片采用SABC法進行BMP-2免疫組化染色，其中一抗工作濃度為1：100。 組織

8、切片經(jīng)胃蛋白酶處理，預雜交液42℃作用4小時后，滴加BMP-2寡核苷酸探針，恒溫箱42℃雜交過夜。 結果: 1.相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)成骨細胞的形態(tài)經(jīng)差速黏附法分離的成骨細胞培養(yǎng)24h后，可見細胞呈梭形、三角形、多角形等散在貼壁生長。7d左右基本長滿培養(yǎng)瓶底。 2.靜磁場對成骨細胞的增殖作用在加磁48h、72h，經(jīng)400Gs和620Gs磁場處理的成骨細胞OD值明顯增加，與0Gs組比較有顯著性差異，P＜0.05。

9、而1080Gs磁場處理組細胞的促增殖作用不明顯，P＞0.05。 3.靜磁場對成骨細胞周期的影響經(jīng)620Gs磁場處理，G0/G1期細胞所在比例降低，S期、G2/M期細胞百分比顯著高于對照組，P＜0.05。經(jīng)1080Gs磁場處理的細胞，其S期和G2/M期細胞百分比與對照組相比無明顯變化。 4.靜磁場對成骨細胞ALP酶的影響成骨細胞漿處均可見有黑色顆粒狀物質，有些融合成片，以磁治療組明顯。靜磁場作用24h后即可觀察到ALP活性

10、增高，620Gs、830Gs靜磁場促進ALP酶的合成作用最強，與對照組相比具有明顯差異，P＜0.05。 5.靜磁場對成骨細胞Ⅰ型膠原的影響成骨細胞的胞漿呈棕黃色，為BMP-2陽性染色。磁場治療組BMP-2陽性細胞染色較深。Western蛋白印記結果表明靜磁場影響Ⅰ型膠原在成骨細胞中的表達，與對照組相比，620Gs作用到72h時，成骨細胞Ⅰ型膠原表達明顯增加。 6.靜磁場對成骨細胞體外鈣化的影響細胞緊密排列，呈多角形、方形

11、等，并可匯集成集落。相差顯微鏡下可見磁場處理組有多個散在的高密度區(qū)，呈折光性很強的亮點，中間的細胞被所分泌的外基質包埋后，形成明顯的鈣化結節(jié)，非磁處理組此現(xiàn)象少見。 7.牙周膜HE染色結果牙周炎組：牙周袋形成，牙周膜纖維排列紊亂，牙槽骨表面凹陷吸收，可見多量破骨細胞。牙周炎磁治療1周組：牙周纖維排列較整齊，牙槽骨表面成骨細胞增多，在骨表面處骨細胞大且明顯。 8.牙周膜電鏡觀測結果牙周炎時成纖維細胞的胞漿減少，細胞器不發(fā)達

12、。牙周炎磁治療1周組成纖維細胞突起多，胞漿豐富，有發(fā)達的粗面內質網(wǎng)和核糖體。9BMP-2染色結果 正常組與牙周炎組間BMP-2蛋白表達無明顯差異，牙周炎磁治療組與牙周炎組間存在明顯差異，P＜0.05。 在牙周炎時，牙周膜成纖維細胞、成牙骨質細胞、成骨細胞及膠原纖維等處可見BMP-2陽性雜交信號。牙周炎磁治療組，BMP-2陽性雜交信號不同程度的增強，以磁治療第2天明顯。 結論: 1.一定強度的靜磁場對體外培

13、養(yǎng)的大鼠顱骨成骨細胞具有促進增殖作用，并且該促增殖作用是通過改變了細胞周期，提高細胞周期中S期和G2/M期百分比而實現(xiàn)的。 2.一定強度的靜磁場具有提高成骨細胞分泌ALP和Ⅰ型膠原的能力，促進細胞鈣化，加速大鼠顱骨成骨細胞的分化。并且這種成骨細胞功能的增加可能與靜磁場促進細胞BMP-2生長因子分泌有關。 3.1200Gs靜磁場可以促進牙周炎牙周膜細胞分泌BMP-2，增加牙槽骨表面成骨細胞的數(shù)量，活躍牙周膜成纖維細胞的功能