腫瘤壞死因子在破骨細(xì)胞形成過程中的雙向作用.pdf

1、背景：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性關(guān)節(jié)炎癥疾病，其發(fā)病率占全球人口的1％，慢性滑膜炎和關(guān)節(jié)損傷、破壞是其主要表現(xiàn)，TNF在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中是主要的致炎因子。在過表達(dá)的TNF轉(zhuǎn)基因小鼠，主要表型就是和人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎很相似的關(guān)節(jié)表現(xiàn)。盡管抗TNF藥物治療能夠明顯地降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的死亡率和骨質(zhì)破壞，但是其相關(guān)藥物價(jià)格昂貴，同時(shí)僅僅大約有60%的患者對這種藥物有反應(yīng)。在對這種藥物沒有反應(yīng)的患者中，往往這種抗TNF藥物在患者應(yīng)用幾個(gè)月才能發(fā)現(xiàn)藥物對患者

2、無明顯作用而換用另一種抗TNF藥物，但是另一種藥物可能對此類患者作用仍然見效甚微。因此，弄清TNF是如何引起關(guān)節(jié)炎癥和關(guān)節(jié)破壞的機(jī)制十分必要。
　　目的：以“TNF對破骨細(xì)胞作用”為主線，由于TNF可以直接或間接地促進(jìn)破骨細(xì)胞形成引起骨量流失，同時(shí)TNF也能通過表達(dá)NF-kB p100抑制破骨細(xì)胞形成，TNF作用于不同破骨細(xì)胞前體為主線利用TNF引起關(guān)節(jié)炎癥和關(guān)節(jié)破壞的反映TNF對破骨細(xì)胞分化的雙向作用機(jī)制。
　　方法：首先

3、為特征性地描述TNF誘導(dǎo)的OCPs，RT-PCR方法檢測細(xì)胞表面標(biāo)記CD11b、F4/80、Ly6C、CD11c和Gr1的表達(dá)，從3月大的野生型（C57B16）小鼠股骨分離出骨髓細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞分別和MCSF、MCSF+TNF、MCSF+RANKL共培養(yǎng)，收集的OCP用抗體染色并流式細(xì)胞學(xué)分析細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)；然后將這三種OCPs分成四類細(xì)胞群，進(jìn)行熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，流式細(xì)胞學(xué)對CD11b+F4/80+源性的

4、Ly6C+Gr1-和Ly6C-Gr1-細(xì)胞群進(jìn)行分類，觀察TNF誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的能力及TNF誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)M1標(biāo)記物；接下來研究TNF誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成過程中RelB的作用，M-OCP、R-OCP和T-OCP形成后分別加入PBS,RANKL,TNF,RANK+TNF繼續(xù)分別培養(yǎng)至破骨細(xì)胞形成，裂解細(xì)胞進(jìn)行Western-Blot分析RelB和β-actin的表達(dá)水平；最后研究RelB在破骨細(xì)胞形成中的雙向作用， C57B16小鼠骨髓細(xì)胞培

5、養(yǎng)，然后處理于1/4量的pMX-GFP或者pMX-GFP-RelB逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，GFP+F4/80+細(xì)胞利用流式細(xì)胞儀分析，GFP和RelB表達(dá)的細(xì)胞分別加入PBS、RANKL和TNF， Western-Blot分析RelB的表達(dá)水平，同時(shí)利用RT-PCR分析NFATc1的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴TNF轉(zhuǎn)化M-CSF誘導(dǎo)的Ly6C-Gr1-M2至Ly6C+Gr1-CD11c＋和Ly6C-Gr1-CD11c＋炎性的M1巨噬細(xì)胞。

6、⑵和M-CSF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞比較， TNF誘導(dǎo)的 CD11b+F4/80+Ly6C+Gr1-和CD11b+F4/80+Ly6C-Gr1-CD11c+巨噬細(xì)胞有更高形成破骨細(xì)胞的潛能。⑶LyLy6C+Gr1-細(xì)胞表達(dá)M1巨噬細(xì)胞，T-OCP源性的Ly6C-Gr1-細(xì)胞同樣可分化至M1巨噬細(xì)胞。⑷TNF誘導(dǎo)RelB促進(jìn)LyLy6C+Gr1-和LyLy6C-Gr1-巨噬細(xì)胞的分化。⑸TNF抑制RANKL誘導(dǎo)M-CSF源性的OCP形成破骨細(xì)胞，