腫瘤壞死因子（TNF-α）對耐藥腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用的研究.pdf

1、目的：化學(xué)治療在腫瘤治療中占有很重要的地位，盡管近年來新的化療藥物不斷出現(xiàn)，化療方案不斷改進(jìn)，惡性腫瘤表現(xiàn)出來的耐藥性一直是復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移乃至治療失敗的主要原因，這是臨床腫瘤治療最常見和最難克服的問題。腫瘤耐藥性可分為先天性耐藥(natural resistance)和獲得性耐藥(acquired resistance)，前者表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物的天然不敏感，后者為腫瘤細(xì)胞因抗癌藥物誘導(dǎo)或其他因素的激活而產(chǎn)生耐藥性。有文獻(xiàn)報(bào)道，一些難治

2、、復(fù)發(fā)的腫瘤患者經(jīng)用細(xì)胞因子和抗癌藥物共同治療后，可以再次獲得緩解，從而提示細(xì)胞因子可能對逆轉(zhuǎn)耐藥有著一定的作用，如：腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、a-干擾素(IFN-a)、粒/單細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)等。很多文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞因子包括TNF通過下調(diào)MDR mRNA的表達(dá)、減少P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的合成、抑制P-gp的功能等多種途徑來改變腫瘤細(xì)

3、胞對化療藥物的耐藥性，而通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來逆轉(zhuǎn)耐藥的報(bào)道還不多見。細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有非常密切的關(guān)系，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可以成為治療惡性腫瘤的新策略。近年來，國內(nèi)外研究已證明許多因素可調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡，如細(xì)胞因子、癌基因、某些中藥等。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是來源于巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的細(xì)胞因子，在體內(nèi)有抗腫瘤活性，不僅能活化腫瘤血管導(dǎo)致組織出血壞死，而且能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)以我校病

4、理教研室自建的小鼠腹水型肝癌細(xì)胞亞系Hca/16A<,3>-F為細(xì)胞株，建立小鼠皮下種植瘤模型，用依托泊苷(Vp-16)治療，誘導(dǎo)該腫瘤細(xì)胞耐藥，一周后建立耐藥模型，再用重組人腫瘤壞死因子α衍生物K2(Rh-TNFα-Dk2)治療，通過電鏡下的形態(tài)學(xué)觀察以及促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2的蛋白表達(dá)情況，來研究TNF-α能否誘導(dǎo)對Vp-16耐藥的腫瘤細(xì)胞凋亡，為克服耐藥尋找新的途徑。 方法：Hca/16A<,3>-F細(xì)胞

5、復(fù)蘇后取第二代腹水，離心后用生理熱水調(diào)整腫瘤細(xì)胞濃度為1×10<'6>/0.2ml，615小鼠右側(cè)腋下皮下注射接種，每只0.2ml，接種后第5～7d出現(xiàn)腫瘤，待種植瘤長至6～10mm時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為4組：陰性對照組(小鼠自然生長)、陽性對照組(Vp-16)、單藥組(Rh-TNFα-Dk2)和聯(lián)合組(Vp-16+Rh-TNFα-Dk2)，每組20只，雌雄各半。各組自接種第8d開始給藥，均為瘤內(nèi)注射。Vp-16連用3d，Rh-TNFα-D

6、k2連用8d。聯(lián)合組小鼠應(yīng)用兩種藥物須間隔一周。從治療開始的前1d(種瘤第7d)，即用游標(biāo)卡尺測量皮下種植瘤的最長徑及與之垂直的最寬徑，每隔1d測量并記錄，計(jì)算瘤體直徑均值。接種第28d隨機(jī)脫頸處死各組一半的小鼠，稱取瘤重，計(jì)算質(zhì)量抑瘤率。取新鮮瘤組織，一部分用10﹪的甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)4μm切片，用于HE染色常規(guī)病理學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)染色，檢測bcl-2和bax蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)情況。另一部份用戊二醛固定，常規(guī)制備透射

7、電鏡標(biāo)本，超薄切片機(jī)切片，透射電鏡下觀察各組瘤細(xì)胞的凋亡情況的差異。各組另一半小鼠在相同條件下喂養(yǎng)，觀察各組小鼠生存期的長短。 結(jié)果：1.由于Vp-16和TNF-α的副作用，Vp-16組、FNF-α組及聯(lián)合組均有不良事件發(fā)生。2.各組荷瘤大小：治療前(種瘤第7d)：各組之間瘤體直徑均值比較均P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；種瘤第10d：聯(lián)合組和陰性對照組比較P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，和Vp-16組、TNF-α組比較P>0.05，沒

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；種瘤第16d及22d：聯(lián)合組和陰性對照組、TNF-α組比較P<0.01、P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，和Vp-16組比較P>0.05，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；種瘤第28d：聯(lián)合組和陰性對照組、TNF-α組比較均P<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，和Vp-16組比較P>0.05，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；種瘤第34d：聯(lián)合組和陰性對照組、TNF-α組比較均P<0.01，和Vp-16組比較P<0.05，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.第28d處死小鼠時(shí)的瘤重

9、及抑瘤率：在第28d，各組之間瘤重比較均P<0.01，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Vp-16組、TNF-α組、聯(lián)合組的抑瘤率分別為48.97﹪、24.20﹪、72.49﹪?？梢钥闯雎?lián)合組在控制瘤重方面優(yōu)勢最為明顯，其次為Vp-16組和TNF-α組。4.生存期比較：聯(lián)合組和陰性對照組、Vp-16組、TNF-α組比較，P<0.01，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Vp-16組、TNF-α組、聯(lián)合組的延命率分別為26.34﹪、22.76﹪、53.20﹪

10、?？梢钥闯雎?lián)合組在延長生存期方面優(yōu)勢最為明顯，其次為Vp-16組和TNF-α組。5.HE染色光鏡結(jié)果：聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞呈片狀、條帶狀壞死，腫瘤組織細(xì)胞核碎裂、溶解，部分壞死組織呈均質(zhì)紅染無結(jié)構(gòu)區(qū)域，其壞死灶明顯多于Vp-16組、TNF-α組及陰性對照組。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組之間腫瘤內(nèi)壞死組織面積百分比比較，均P<0.05差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6．電鏡結(jié)果：聯(lián)合組凋亡細(xì)胞很多，很重，很典型，并且展示了凋亡過程的不同階段。而Vp-16組和T

11、NF-α組鏡下所見，凋亡細(xì)胞不是很多，不典型。陰性對照組自發(fā)凋亡的細(xì)胞更少。7．免疫組織化學(xué)染色分析：bcl-2蛋白的表達(dá)情況：bcl-2蛋白的表達(dá)量最多為陰性對照組，依次為Vp-16組、聯(lián)合組、TNF-α組。除TNF-α、聯(lián)合組之間比較P>0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義之外，其他各組之間比較P<0.05或P<0.01，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。bax蛋白的表達(dá)情況：bax蛋白的表達(dá)量最多為聯(lián)合組，依次為TNF-α組、Vp-16組、陰性對