saRNA介導(dǎo)的TRPV5表達(dá)在預(yù)防含鈣尿路結(jié)石中的作用研究.pdf

1、泌尿系結(jié)石的高復(fù)發(fā)率凸顯了預(yù)防其復(fù)發(fā)在避免患者反復(fù)接受手術(shù)治療中的重要意義。而高鈣尿是泌尿系統(tǒng)含鈣結(jié)石發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。高選擇性鈣離子通道TRPV5主要分布于腎遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞頂膜側(cè)，其介導(dǎo)的鈣離子由頂膜側(cè)向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)是腎臟鈣離子主動(dòng)重吸收的限速步驟。TRPV5基因敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的高鈣尿。我們的前期研究顯示，TRPV5在草酸鈣結(jié)石模型大鼠和遺傳性高鈣尿結(jié)石大鼠腎臟中顯著低表達(dá)。我們進(jìn)一步的研究顯示泌尿系含鈣結(jié)石患者腎組織TRPV

2、5表達(dá)較對(duì)照組顯著降低。因而，TRPV5成為預(yù)防腎含鈣結(jié)石的理想標(biāo)靶基因。上調(diào)TRPV5表達(dá)水平有助于增加尿鈣重吸收，從而降低尿鈣水平，為泌尿系含鈣結(jié)石的預(yù)防提供新的手段。近年，人工合成的小雙鏈RNA（dsRNA）及微小RNA（microRNA）均被證明可以有效上調(diào)基因表達(dá)水平，而非沉默靶基因表達(dá)。這種新發(fā)現(xiàn)的機(jī)制被稱為“RNA激活”（RNAa）。在本研究中，靶向基因啟動(dòng)子區(qū)域的dsRNA顯著激活了TRPV5鈣離子通道表達(dá)，并上調(diào)了細(xì)胞

3、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)水平。
　　研究目的:
　　本研究利用靶向基因啟動(dòng)子區(qū)域的小激活RNA激活TRPV5表達(dá)，研究其對(duì)細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。同時(shí)探究小激活RNA對(duì)二氫睪酮誘導(dǎo)的細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制效應(yīng)的恢復(fù)作用。從而探討靶向TRPV5基因啟動(dòng)子的小激活RNA在泌尿系含鈣結(jié)石預(yù)防中的應(yīng)用價(jià)值。
　　研究?jī)?nèi)容和方法:
　　1.設(shè)計(jì)合成3個(gè)靶向TRPV5啟動(dòng)子區(qū)域的dsRNA序列，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將之轉(zhuǎn)染入HK2細(xì)胞中。使用Wes

4、tern Blot、PCR和細(xì)胞免疫熒光的方法檢測(cè)TRPV5表達(dá)變化，從而篩選出可有效上調(diào)TRPV5表達(dá)的dsRNA。并使用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)篩選出的dsRNA對(duì)TRPV5膜豐度的影響。
　　2.將篩選出的有效的dsRNA以不同時(shí)間和濃度作用于HK2細(xì)胞。以檢測(cè)其時(shí)間和濃度依從性。
　　3.將篩選出的dsRNA分別轉(zhuǎn)染入PC3、HEK293和HK2細(xì)胞中，以檢測(cè)其細(xì)胞特異性。同時(shí)檢測(cè)上述3種細(xì)胞系TRPV5基礎(chǔ)表達(dá)水平。

5、>　　4.在不同濃度和不同時(shí)間下使用二氫睪酮處理HK2細(xì)胞，并使用Western Blot檢測(cè)其對(duì)TRPV5表達(dá)的影響。
　　5.使用Fura-2鈣離子熒光探針檢測(cè)HK2細(xì)胞小激活RNA、二氫睪酮以及二者共處理下細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)水平變化。
　　結(jié)果:
　　1.在設(shè)計(jì)合成的3個(gè)靶向TRPV5基因啟動(dòng)子的dsRNA中ds-2939有效上調(diào)了HK2細(xì)胞 TRPV5的mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。免疫熒光結(jié)果顯示ds-2939顯

6、著增加了TRPV5在HK2細(xì)胞的膜豐度。
　　2.ds-2939對(duì)TRPV5表達(dá)水平的激活作用在1天至6天和5nM至80nM具有時(shí)間和濃度依從性。
　　3.ds-2939在TRPV5基礎(chǔ)表達(dá)量較低的PC3和HK2細(xì)胞中激活效果明顯。在靶基因基礎(chǔ)表達(dá)量較高的HEK293細(xì)胞中未能觀察到激活效果。
　　4.二氫睪酮在12至48小時(shí)和5nM至20nM依從時(shí)間和濃度對(duì)HK2細(xì)胞TRPV5表達(dá)水平產(chǎn)生抑制作用。
　　5.與