TRPV5在腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠腎中的表達(dá)及意義.pdf

1、泌尿系結(jié)石是一個(gè)全球性的疾病，也是我國(guó)最常見的泌尿外科疾病之一。其發(fā)病率高且呈逐年上升趨勢(shì)，治療后亦容易復(fù)發(fā)，目前尚不能對(duì)其進(jìn)行有效地預(yù)防。因此，對(duì)泌尿系結(jié)石病因的研究，進(jìn)而預(yù)防泌尿系結(jié)石的形成具有重要的臨床意義。 泌尿系結(jié)石由多因素共同作用所致，其主要的病因包括遺傳、環(huán)境、飲食與代謝等。隨著科學(xué)的發(fā)展，遺傳及代謝成為了近年來(lái)的主要研究熱點(diǎn)。鈣是泌尿系結(jié)石成分中最主要的陽(yáng)離子，草酸鈣結(jié)石占泌尿系結(jié)石中的大多數(shù)，而且含鈣結(jié)石病人中

2、約1/3合并高鈣尿癥。物理化學(xué)研究表明，尿液中的草酸鈣和磷酸鈣的飽和度與尿鈣的濃度有關(guān)，尿鈣增高易于誘發(fā)或促進(jìn)含鈣尿路結(jié)石的形成。因此，鈣代謝異常導(dǎo)致的高鈣尿在形成泌尿系結(jié)石中的作用越來(lái)越引起人們的重視。 尿鈣水平取決于腎小球?qū)︹}的濾過(guò)與腎小管對(duì)鈣的重吸收。腎小管對(duì)鈣的重吸收包括被動(dòng)重吸收和主動(dòng)重吸收。被動(dòng)重吸收的鈣量約占總重吸收鈣量的85％，主要通過(guò)近曲小管和髓袢升支的細(xì)胞旁緊密連接進(jìn)行，由Na+-K+ATP泵及水的重吸收產(chǎn)生

3、的電化學(xué)梯度介導(dǎo)。主動(dòng)重吸收主要發(fā)生在腎遠(yuǎn)曲小管和集合管，占總重吸收量的15％。雖然被動(dòng)重吸收占了總重吸收量的大多數(shù)，但由于被動(dòng)重吸收不能被特異的調(diào)節(jié)，故對(duì)尿鈣水平的影響較少；而主動(dòng)重吸收，是一種耗能的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，許多尿鈣的調(diào)節(jié)因子均作用于主動(dòng)重吸收，故主動(dòng)重吸收對(duì)尿鈣水平影響較大，是控制尿鈣水平的主要因素。 TRPV5是瞬時(shí)性受體電位通道（TRP）vanilloid受體亞類成員之一，其基因在人類位于7q35染色體，由15個(gè)外顯

4、子構(gòu)成，編碼的蛋白大約包含730個(gè)氨基酸，組成了6個(gè)跨膜區(qū)、一個(gè)Ca2+孔區(qū)和位于細(xì)胞內(nèi)的氨基端和羧基端。TRPV5的Ca2+孔區(qū)對(duì)鈣離子具有高度選擇性，包括4個(gè)天冬氨酸殘?bào)w（D452），它們共同組成了一個(gè)帶負(fù)電荷的環(huán)，可作為Ca2+的選擇濾器。近年的研究表明，TRPV5主要在腎遠(yuǎn)曲小管和集合管上皮細(xì)胞中表達(dá)，是介導(dǎo)遠(yuǎn)曲小管和集合管對(duì)鈣主動(dòng)重吸收的主要蛋白，在調(diào)控尿鈣水平中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其表達(dá)下降或活性降低可能導(dǎo)致尿鈣水平增高。

5、 TRPV5異常能導(dǎo)致高尿鈣，而高尿鈣能促進(jìn)泌尿系結(jié)石的形成，對(duì)此提出疑問(wèn)——TRPV5異常是不是泌尿系結(jié)石的病因呢?本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定TRPV5基因及蛋白在大鼠草酸鈣結(jié)石模型腎中的表達(dá)，初步探討TRPV5表達(dá)在腎結(jié)石形成中的作用，為預(yù)防腎結(jié)石形成提供理論依據(jù)。 研究目的：通過(guò)蛋白及基因水平的研究，探討TRPV5表達(dá)在腎結(jié)石形成中的作用，為預(yù)防。腎結(jié)石形成提供理論依據(jù)。 研究方法：

6、 1.構(gòu)建大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型：采用含1％乙二醇+1％氯化銨的溶液喂養(yǎng)SD大鼠4周。 2.使用代謝籠收集大鼠24小時(shí)尿液，隔日無(wú)菌取血。分析大鼠血鈣、尿鈣變化。 3.處死大鼠，無(wú)菌取大鼠兩側(cè)腎臟。 4.用一側(cè)腎臟做成石蠟切片，進(jìn)行HE染色，通過(guò)檢測(cè)切片中有無(wú)結(jié)石結(jié)晶存在來(lái)判斷造模是否成功。 5.另取切片進(jìn)行免疫組化染色，從蛋白水平分析TRPV5蛋白在腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠腎中的表達(dá)。 6.使用另一

7、側(cè)腎臟分離出。腎皮質(zhì)，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，從基因水平分析TRPV5 mRNA在腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠腎中的表達(dá)。 7.統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 研究結(jié)果： 1.一般資料：喂養(yǎng)4周后，所有大鼠均存活。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組、結(jié)石組大鼠平均體重分別較實(shí)驗(yàn)開始時(shí)增加了85.62±17.41g和80.45±19.76g。將每只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的體重減去實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的體重得到凈增體重，用t檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)

8、，大鼠增加的體重在兩組間無(wú)明顯差異。 2.血、尿生化檢查結(jié)果：兩組大鼠血鈣比較無(wú)明顯差異，且均在正常范圍內(nèi)。結(jié)石組大鼠的24小時(shí)尿鈣排泄量明顯高于正常組大鼠，約為其2倍（0.74±0.12 v0.39±0.06）。 3.病理檢查結(jié)果：偏光顯微鏡下觀察。腎組織病理切片，結(jié)石組能在腎小管區(qū)觀察到大量結(jié)石結(jié)晶，且多位于腎小管充血、上皮細(xì)胞脫落區(qū)域，但正常組大鼠腎病理切片則不能觀察到結(jié)石結(jié)晶。 4.免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

9、對(duì)兩組大鼠的腎組織進(jìn)行免疫組化檢查，采用Image-pro plus6.0圖像分析軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示結(jié)石組大鼠腎組織的TRPV5蛋白表達(dá)水平明顯低于其在正常組大鼠腎組織中的表達(dá)水平。 5.熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)熒光定量PCR儀測(cè)得的CT值，計(jì)算出TRPV5 CT值/GAPDH CT值，使用t檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示TRPV5 mRNA在結(jié)石組大鼠腎組織中的表達(dá)水平明顯低于其在正常組大鼠腎組織中的表達(dá)水平。