維生素D受體在人腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、腹膜透析(PD)是終末期腎臟病(ESRD)重要替代療法之一。長(zhǎng)期腹膜透析患者可以導(dǎo)致腹膜纖維化，進(jìn)而引起腹膜失超濾是腹膜透析患者退出腹膜透析治療的重要原因之一。長(zhǎng)期腹透患者腹膜長(zhǎng)期暴露在高糖透析液中，生物不相容的腹透液能導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞失去正常的形態(tài)和功能，最終導(dǎo)致腹膜纖維化和腹膜失超濾。高糖(HG)所致的腹膜上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)能導(dǎo)致腹膜纖維化和超濾喪失。它可導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞失去間皮細(xì)胞的特點(diǎn)，如細(xì)胞極性和粘附，E-c

2、adherin等表達(dá)減少，向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，如遷移和侵襲，同時(shí)α-SMA、FN表達(dá)升高。因此，延緩EMT的進(jìn)展對(duì)緩解腹膜纖維化及保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞具有重要的意義。
　　近年來(lái)研究表明，維生素D除了調(diào)節(jié)鈣、磷的代謝，其新的生物學(xué)功能逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，如調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化及調(diào)節(jié)免疫功能等。VDR在導(dǎo)致的人腹膜間皮細(xì)胞(HPMCs)EMT中的作用及相關(guān)機(jī)制尚不清楚。
　　本項(xiàng)目在既往工作基礎(chǔ)上，利用體外人腹膜間皮細(xì)胞EMT模型，檢測(cè)V

3、DR的表達(dá)及EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、α-SMA、FN等信號(hào)分子的基因、蛋白表達(dá)以及應(yīng)用VDR的配體1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達(dá)后EMT的變化;采用shRNA干擾，研究VDR表達(dá)下調(diào)后EMT變化以及TGFβ/Smad信號(hào)通路在腹膜EMT中的調(diào)控作用。進(jìn)一步觀察VDR調(diào)控該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用靶點(diǎn)，探討其抗腹膜纖維化的細(xì)胞分子機(jī)制，以期探尋腹膜失超濾的新機(jī)制和防治的新策略。
　　論文一 VDR在人腹膜間皮細(xì)胞EM

4、T模型中的表達(dá)及其與EMT的關(guān)系
　　目的：
　　利用人腹膜間皮細(xì)胞EMT模型，初步探討EMT過(guò)程中VDR的表達(dá)及與EMT的關(guān)系
　　方法：
　　（一）實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
　　人腹膜間皮細(xì)胞株(HMrSV)由法國(guó)巴黎TENON醫(yī)院Pierre RONCO教授建立;由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院徐惠綿教授及那迪醫(yī)師饋贈(zèng)。
　　（二）實(shí)驗(yàn)方法
　　應(yīng)用高糖刺激人腹膜間皮細(xì)胞株，建立人腹膜間皮細(xì)胞EMT模型，運(yùn)用Rea

5、ltime PCR、Western Blot方法檢測(cè)高糖刺激人腹膜間皮細(xì)胞不同濃度及不同時(shí)間后上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin及間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和FN信號(hào)分子的基因、蛋白表達(dá)水平及VDR表達(dá)水平變化。
　　（三）實(shí)驗(yàn)分組
　　1、對(duì)照組:只加入10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基（葡萄糖濃度0.2％）作用24h。
　　2、高糖作用不同濃度組:加入10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基并且含不同濃度1.5％，2.5％，4.

6、25％的葡萄糖作用24h。
　　3、高糖作用不同時(shí)間組:2.5％葡萄糖分別作用0，6，12h，24h，48h。
　　結(jié)果：
　　1、不同濃度葡萄糖對(duì)HPMCs的VDR表達(dá)的影響
　　Real time PCR及Western Blot結(jié)果顯示，1.5％濃度的葡萄糖作用于HPMCs可使 HPMCs的VDR從mRNA和蛋白水平表達(dá)均減少。并且隨著葡萄糖濃度增加，VDRmRNA和蛋白表達(dá)逐漸減少，4.25％葡萄糖作用達(dá)

7、到最強(qiáng)。
　　2、葡萄糖作用不同時(shí)間對(duì)HPMCs的VDR表達(dá)的影響
　　Real time PCR及Western Blot結(jié)果顯示，2.5％葡萄糖作用6小時(shí)HPMCs的VDRmRNA和蛋白表達(dá)減少。并且隨著葡萄糖作用時(shí)間延長(zhǎng)，VDRmRNA和蛋白表達(dá)逐漸減少，2.5％葡萄糖作用HPMCs48小時(shí)VDRmRNA和蛋白表達(dá)最少。
　　3、不同濃度葡萄糖對(duì)HPMCs的EMT的影響
　　Western Blot結(jié)果顯示

8、，1.5％葡萄糖可使HPMCs的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、FN蛋白表達(dá)增加，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)減少，提示腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT改變。且隨著葡萄糖濃度增加，EMT改變逐漸明顯，4.25％葡萄糖作用最強(qiáng)。
　　4、葡萄糖作用不同時(shí)間對(duì)HPMCs的EMT的影響
　　Western Blot結(jié)果顯示，2.5％葡萄糖作用6小時(shí)HPMCs的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、FN蛋白表達(dá)增加，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadher

9、in表達(dá)減少，提示腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT改變。并且隨著葡萄糖作用時(shí)間延長(zhǎng)，EMT改變逐漸明顯，2.5％葡萄糖作用HPMCs48小時(shí)EMT改變最明顯。
　　結(jié)論：
　　1、人腹膜間皮細(xì)胞存在VDR的表達(dá)。
　　2、高糖從基因及蛋白的水平以濃度依賴及時(shí)間依賴的方式下調(diào)體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞VDR的表達(dá)。
　　3、高糖從以濃度依賴及時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)EMT，EMT與VDR表達(dá)負(fù)相關(guān)。
　　論文二 上調(diào)及下調(diào)VD

10、R表達(dá)后對(duì)HPMCs細(xì)胞EMT的影響
　　目的：
　　觀察應(yīng)用1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達(dá)后對(duì)EMT的影響。構(gòu)建VDRshRNA質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染腹膜間皮細(xì)胞。觀察應(yīng)用VDRshRNA下調(diào)VDR表達(dá)后對(duì)EMT的影響。探討VDR在HPMCs細(xì)胞EMT過(guò)程中的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　常規(guī)培養(yǎng)HPMCs，應(yīng)用2.5％葡萄糖刺激HPMCs細(xì)胞24h制造HPMCs EMT模型，在此過(guò)程中分別用1，25(OH)2D3刺

11、激HPMCs上調(diào)VDR表達(dá)，應(yīng)用VDRshRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HPMCs下調(diào)VDR表達(dá)，運(yùn)用Real time PCR、Western Blot、免疫熒光等方法檢測(cè)VDR表達(dá)水平及分別上調(diào)和下調(diào)VDR表達(dá)后EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、α-SMA、FN等信號(hào)分子的變化水平。
　　結(jié)果：
　　1、1，25(OH)2D3對(duì)高糖刺激下人腹膜間皮細(xì)胞EMT的影響
　　Western Blot結(jié)果顯示，2.5％高糖刺激HPMC

12、s24小時(shí)能顯著上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物αSMA，F(xiàn)N表達(dá)水平，下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)，提示腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生了EMT改變。應(yīng)用10-7 mol/L1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達(dá)后，顯著下調(diào)αSMA，F(xiàn)N表達(dá)水平，上調(diào)E-cadherin表達(dá)水平，提示1，25(OH)2D3能夠部分逆轉(zhuǎn)腹膜間皮細(xì)胞EMT的發(fā)生。免疫熒光結(jié)果亦表明，高糖能顯著上調(diào)αSMA表達(dá)，應(yīng)用1，25(OH)2D3后能夠部分逆轉(zhuǎn)高糖所致的αSMA表

13、達(dá)上調(diào)。
　　2、VDRshRNA對(duì)高糖刺激下人腹膜間皮細(xì)胞EMT的影響
　　Western Blot結(jié)果顯示，高糖能顯著上調(diào)αSMA，F(xiàn)N表達(dá)水平，下調(diào)E-cadherin表達(dá)，提示腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生了EMT改變。應(yīng)用VDRshRNA轉(zhuǎn)染腹膜間皮細(xì)胞下調(diào)VDR表達(dá)后，EMT標(biāo)志物αSMA，F(xiàn)N表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，E-cadherin表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，提示應(yīng)用VDRshRNA下調(diào)VDR表達(dá)能夠加劇腹膜間皮細(xì)胞EMT改變。
　　

14、結(jié)論：
　　1、高糖能夠誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT改變。應(yīng)用1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達(dá)能夠部分逆轉(zhuǎn)腹膜間皮細(xì)胞EMT的發(fā)生。
　　2、應(yīng)用VDRshRNA下調(diào)VDR表達(dá)后能夠加劇腹膜間皮細(xì)胞EMT改變。
　　論文三 TGFβ/Smad通路對(duì)HPMCs細(xì)胞EMT的影響
　　目的：
　　觀察應(yīng)用1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達(dá)后TGFβ/Smad通路的變化。構(gòu)建VDRshRNA質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染腹膜間皮

15、細(xì)胞。觀察應(yīng)用VDRshRNA下調(diào)VDR表達(dá)后TGFβ/Smad通路的變化。探討TGFβ/Smad通路在HPMCs細(xì)胞EMT過(guò)程中的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　常規(guī)培養(yǎng)HPMCs，用2.5％葡萄糖刺激HPMCs細(xì)胞24h制造HPMCs EMT模型，在此過(guò)程中分別用1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達(dá)，應(yīng)用VDRshRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HPMCs下調(diào)VDR表達(dá)，運(yùn)用Real time PCR、Western Blot等方法檢測(cè)TG

16、Fβ，Smad3，p-Smad3等信號(hào)分子的變化水平。
　　結(jié)果：
　　1、1，25(OH)2D3對(duì)高糖刺激下人腹膜間皮細(xì)胞TGFβ/Smad通路的影響Real time PCR結(jié)果顯示，高糖能顯著上調(diào)TGFβmRNA表達(dá)水平，應(yīng)用1，25(OH)2D3預(yù)孵育后能夠部分下調(diào)腹膜間皮細(xì)胞TGFβmRNA表達(dá)水平。WesternBlot結(jié)果顯示，高糖能顯著上調(diào)TGFβ及磷酸化Smad3蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用1，25(OH)2D3預(yù)孵

17、育后能夠部分下調(diào)腹膜間皮細(xì)胞TGFβ及磷酸化Smad3蛋白表達(dá)。
　　2、VDR表達(dá)對(duì)高糖刺激下人腹膜間皮細(xì)胞TGFβ/Smad通路的影響
　　Real time PCR結(jié)果顯示，高糖能顯著上調(diào)TGFβmRNA表達(dá)水平，應(yīng)用1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達(dá)能夠部分逆轉(zhuǎn)腹膜間皮細(xì)胞TGFβmRNA表達(dá)水平，應(yīng)用VDRshRNA下調(diào)VDR表達(dá)后能夠進(jìn)一步上調(diào)腹膜間皮細(xì)胞TGFβmRNA表達(dá)水平。Western Blot結(jié)果顯

18、示，高糖能顯著上調(diào)TGFβ及磷酸化Smad3蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達(dá)能夠下調(diào)腹膜間皮細(xì)胞TGFβ及磷酸化Smad3蛋白表達(dá)，應(yīng)用VDRshRNA下調(diào)VDR表達(dá)后能夠進(jìn)一步上調(diào)腹膜間皮細(xì)胞TGFβ及磷酸化Smad3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1、高糖能夠激活TGFβ/Smad信號(hào)通路，應(yīng)用1，25(OH)2D3上調(diào)VDR表達(dá)后能夠通過(guò)下調(diào)TGFβ/Smad信號(hào)通路從而緩解人腹膜間皮細(xì)胞EMT。