Galectin-1在高糖腹透液誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用.pdf

1、背景：腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)是腎臟替代治療三種方式之一。超濾衰竭(Ultrafiltration Failure,UFF)是腹膜透析病人退出治療的最主要的原因之一。已有大量研究證實(shí)，高濃度的葡萄糖腹透液引起腹膜形態(tài)和功能的改變，腹膜細(xì)胞的損傷和修復(fù)甚至細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial-to-mesenchymal Transition,EMT)，最終導(dǎo)致腹膜纖維化(Peritoneal fi

2、brosis,PF)和超濾衰竭的發(fā)生。但目前關(guān)于腹膜纖維化的分子機(jī)制仍未完全闡明。
　　 Galectin-1是第一個(gè)被報(bào)道的哺乳動(dòng)物半乳糖凝集素，參與細(xì)胞的粘附、增殖、分化、凋亡，炎癥反應(yīng)等多種生理、病理過(guò)程，并在免疫系統(tǒng)及腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。我們以往的研究通過(guò)蛋白組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)高糖刺激腹膜間皮細(xì)胞后galectin-1表達(dá)明顯上調(diào)，推測(cè)galectin-1可能在腹膜纖維化某一環(huán)節(jié)起作用。最新的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)galect

3、in-1通過(guò)阻斷TGF-β/Smad通路抑制腎小管上皮細(xì)胞膠原Ⅰ的表達(dá)，但galectin-1在高糖腹透液誘導(dǎo)體外腹膜間皮細(xì)胞EMT的表達(dá)及與EMT的關(guān)系國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 vimentin和zo-1是常用的EMT相關(guān)的指標(biāo)。波形蛋白(vimentin)是間質(zhì)細(xì)胞中最主要的中間纖維，它存在于中胚層起源的細(xì)胞中，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞等，并與微管、微絲共同形成了一個(gè)細(xì)胞支架網(wǎng)絡(luò)而維持細(xì)胞完整性。緊密連接相關(guān)蛋白1(z

4、onulaoccluden-1,ZO-1)則是組成緊密連接的支架，是維持血管和腹透液兩側(cè)滲透壓梯度的相關(guān)結(jié)構(gòu)。Vimentin的表達(dá)增加和zo-1的表達(dá)丟失提示細(xì)胞可能發(fā)生EMT。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈RNA(doublestranded RNA,DsRNA)誘導(dǎo)與之同源的mRNA降解，從而引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(post-transcriptional gene Silenc

5、ing,PTGS)，目前已成功用于基因功能和信號(hào)傳遞系統(tǒng)上下游分子相互關(guān)系的研究，有可能成為繼反義核酸，核酶之后的又一新手段。
　　 第一章高糖腹透液對(duì)腹膜間皮細(xì)胞galectin-1表達(dá)的影響
　　 目的：通過(guò)觀察不同濃度葡萄糖腹透液對(duì)腹膜間皮細(xì)胞(HPMC)galectin-1及EMT相關(guān)指標(biāo)vimentin、zo-1表達(dá)的影響，初步探討galectin-1與EMT的關(guān)系。
　　 方法：以人腹膜間皮細(xì)胞株為研

6、究對(duì)象，隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組(5.5mmol/L)，1.5％PDS組，2.5％PDS組及4.25％PDS組。采用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)測(cè)定galectin-1，vimentin和zo-1mRNA水平的表達(dá)；采用蛋白印跡(Westem-blot)方法，測(cè)定galectin-1，vimentin和zo-1蛋白水平的表達(dá)。分析galectin-1與Vimentin，zo-1表達(dá)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：

7、　　 (1)正常培養(yǎng)條件下，HPMC表達(dá)galectin-1，僅表達(dá)少量的vimentin和一定量的zo-1。
　　 (2)4.25％PDS刺激HPMC不同時(shí)間，galectin-1蛋白表達(dá)量逐漸增高，12h，24h，48h galectin-1的蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的1.09倍，1.22倍和1.42倍，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。72h galectin-1的蛋白表達(dá)量較前稍下降，為對(duì)照組的1.37倍，與對(duì)照組比較有統(tǒng)

8、計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 (3)不同濃度葡萄糖腹透液刺激HPMC galectin-1 mRNA和蛋白水平的表達(dá)逐漸增高，呈濃度依賴(lài)性。Galectin-1mRNA表達(dá)量分別為對(duì)照組的1.22倍，1.535倍和2.34倍(P＜0.05)。1.5％PDS組，2.5％PDS組，4.25％PDS組galectin-1的蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的1.48倍，2.01倍和2.38倍，與對(duì)照組相比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。<

9、br>　　 (4)高糖PDS刺激HPMC48h后，vimentin mRNA和蛋白水平表達(dá)顯著上調(diào)，呈濃度依賴(lài)性。與對(duì)照組相比較，vimentin mRNA的表達(dá)分別為對(duì)照組的1.16倍，1.27倍和1.69倍(P＜0.05)。vimentin蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的1.28倍，1.51倍1.92倍(P＜0.05)。
　　 (5)高糖PDS刺激HPMC48h后，zo-1 mRNA和蛋白水平表達(dá)顯著下調(diào)，呈濃度依賴(lài)性。與對(duì)照組相

10、比較，zo-1 mRNA的表達(dá)分別為對(duì)照的77％，43％(P＜0.05)和20％(P＜0.05)。zo-1蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的88％，52％(P＜0.05)和40％(P＜0.05)。
　　 (6)galectin-1 mRNA表達(dá)與vimentin mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r＝0.864,P＜0.05)，與zo-1 mRNA表達(dá)呈相關(guān)(r＝-0.604,P＜0.05)；galectin-1蛋白水平表達(dá)與vimentin蛋白水平

11、表達(dá)呈正相關(guān)(r＝0.917,P＜0.05)；galectin-1蛋白水平表達(dá)與zo-1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r＝0.869,P＜0.05)
　　 結(jié)論：
　　 (1)galectin-1在人腹膜間皮細(xì)胞(HPMCs)有表達(dá)，高糖腹透液能上調(diào)galectin-1的表達(dá)，且呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。
　　 (2)高糖腹透液能誘導(dǎo)HPMCs發(fā)生轉(zhuǎn)分化。
　　 (3)galectin-1與高糖腹透液誘導(dǎo)HPMCs轉(zhuǎn)分化相

12、關(guān)。
　　 第二章 galectin-1 siRNA對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響
　　 目的：轉(zhuǎn)染galectin-1 siRNA抑制人腹膜間皮細(xì)胞galectin-1的表達(dá)，檢測(cè)vimentin、zo-1的表達(dá)，觀察galectin-1siRNA能否抑制高糖腹透液誘導(dǎo)的HPMCs轉(zhuǎn)分化。
　　 方法：以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染siRNA至HPMC，把HPMC分為3組：正常對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染HPMC＋5.5mmol/L葡萄糖），

13、高糖組（未轉(zhuǎn)染HPMC＋4.25％高糖PDS刺激組）和轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染galectin-1 siRNA的HPMC＋1.25％高糖PDS刺激）。采用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)測(cè)定galectin-1，vimentin和zo-1mRNA水平的表達(dá)；采用蛋白印跡(Westem-blot)方法，測(cè)定galectin-1，vimentin和zo-1蛋白水平的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)4.25％高糖PDS刺激H

14、PMCs48h，galectin-1 mRNA及蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組均顯著上調(diào)(P＜0.05)。vimentin mRNA及蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組上調(diào)，zo-1 mRNA及蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組下調(diào)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 (2)galectin-1siRNA轉(zhuǎn)染入HPMCs后，與高糖刺激組相比較，galectin-1 mRNA及蛋白的表達(dá)均被抑制(P＜0.05)，同時(shí)vimentin mRNA及蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，