microRNA302c在腹透流出液培養(yǎng)的腹膜間皮細(xì)胞中的表達(dá)及與EMT的關(guān)系.pdf

1、背景：持續(xù)不臥床腹膜透析(Continuous ambulatory peritoneal dialysis,CAPD)是終末期腎臟疾病(End-stage renal disease,ESRD)的主要替代治療方法之一。長(zhǎng)期接受CAPD的患者，腹膜長(zhǎng)期暴露在生物不相容性的腹透液中，導(dǎo)致了腹膜間皮細(xì)胞剝脫，最終發(fā)生腹膜纖維化和超濾衰竭(Ultrafiltration failure,UFF)，是導(dǎo)致患者退出腹膜透析的主要原因。腹膜間皮細(xì)胞

2、(Peritoneal mesothelial cells,PMCs)被認(rèn)為是引起纖維化的主要細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)可能是肌成纖維細(xì)胞的重要來源之一，最近研究進(jìn)一步證明EMT是腹膜纖維化的起始環(huán)節(jié)，且TGF-β1信號(hào)通路在腹膜纖維化中起決定作用，而結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是TGF-β1的主要致纖維化下游因子。microRNA302

3、c屬于microRNA302家族成員之一，通過生物模型程序分析發(fā)現(xiàn)microRNA302c在調(diào)節(jié)CTGF表達(dá)中起可能起一個(gè)關(guān)鍵的作用，但是目前國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。
　　 目的：探討micorRNA302c在調(diào)節(jié)腹膜間皮細(xì)胞CTGF表達(dá)及EMT發(fā)生中的作用和分子機(jī)制。
　　 方法：(1)將中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院及湘雅三醫(yī)院腹膜透析中心的CAPD患者，按腹透時(shí)間分為兩組：①新開管組（A組）②腹透一年以上組（B組），取其夜間留腹腹

4、透液分離培養(yǎng)人的腹膜間皮細(xì)胞，培養(yǎng)十四天經(jīng)倒置相差顯微鏡和免疫組化染色(Immunohistochemistry,HIS)鑒定，后原代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。(2)相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的改變(3)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的Taqman熒光探針法檢測(cè)microRNA302c在上述兩組腹膜間皮細(xì)胞中的表達(dá)；(4)分別用Westem-blot、Real time PCR法觀察CTGF、vimentin和zo-1在蛋白水平以及RNA水平上的表達(dá)

5、；(5)分析microRNA302c表達(dá)與CTGF以及vimentin、zo-1表達(dá)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：(1)經(jīng)鑒定，腹透流出液中培養(yǎng)的細(xì)胞95％以上為人腹膜間皮細(xì)胞(HPMCs）。(2)相差倒置顯微鏡觀察新開管的患者腹透流出液培養(yǎng)的HPMCs形態(tài)上一小部分呈圓形、橢圓形的上皮樣細(xì)胞，融合后呈鋪路石狀，與大網(wǎng)膜培養(yǎng)的腹膜間皮細(xì)胞相似；而大部分為上皮樣細(xì)胞和梭形的纖維樣細(xì)胞的混合存在；B組的患者腹透流出液培養(yǎng)的HPMCs多為梭

6、形的纖維樣細(xì)胞。(3)Real time PCRTaqman熒光探針法顯示microRNA302c在腹膜間皮細(xì)胞中有表達(dá)，并且B組的患者腹透流出液培養(yǎng)的HPMCs的表達(dá)水平明顯低于A組患者的(P＜0.05)。(4)Real time PCR顯示B組的患者腹透流出液培養(yǎng)的HPMCs Zo-1 mRNA表達(dá)水平明顯低于A組患者的(P＜0.05)；B組的患者腹透流出液培養(yǎng)的HPMCs CTGF、VimentinmRNA表達(dá)水平明顯高于A組患者

7、的(P＜0.05)。Westem-blot顯示B組的患者腹透流出液培養(yǎng)的HPMCs Zo-1蛋白表達(dá)水平比A組的表達(dá)水平下調(diào)(P＜0.05)；B組的患者腹透流出液培養(yǎng)的HPMCsCTGF、Vimentin蛋白表達(dá)水平比新開管患者的表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05)。(5)A組和B組患者的腹透流出液培養(yǎng)的HPMCs兩組細(xì)胞microRNA302c表達(dá)與CTGF mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r＝-0.54；microRNA302c表達(dá)與Vime

8、ntin mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r＝-0.884；microRNA302c表達(dá)與Zo-1 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r＝0.86；CTGF mRNA與Vimentin mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r＝0.83；CTGF mRNA與Zo-1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r＝-0.72。均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)
　　 結(jié)論：(1)microRNA302c在腹透流出液中培養(yǎng)的HPMCs上有表達(dá)，并且microRN