尿酸對腹膜間皮細胞增殖及表達炎癥因子的影響.pdf

1、估計全人類有一百多萬人遭受終末期腎臟疾病的折磨，而且這類患者正在以每年6-7％的比例增加，治療選擇包括腹膜透析、血液透析和腎臟移植。腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是慢性腎功能衰竭的重要替代治療方法之一。與HD相比，PD在開始透析的3～5年內(nèi)總體生存率方面優(yōu)于HD；患者在家自行完成；不用打針；更好的清除中分子毒素；PD能更好地延緩殘余腎功能下降；PD患者移植腎功能恢復延遲發(fā)生率低；獲得血源性病毒感染的危險性較小。

2、因此，有學者認為PD應占透析總人數(shù)的32％～45％為宜。目前，全球大約有15％(＞130,000人)的透析患者采用PD方式，而我國大陸PD患者僅占透析治療的10％左右。因此，PD在我國有非常廣闊的發(fā)展前景。但PD發(fā)展也存在制約因素，CAPD患者還存在腹腔局部的慢性炎癥狀態(tài)，介導腹膜纖維化的發(fā)生，腹膜纖維化導致的超濾功能喪失是維持性腹膜透析患者退出的主要原因。 臨床中我們注意到，CAPD患者存在高尿酸血癥，患者腹膜透析灌洗液中尿酸

3、水平增高，異常尿酸水平，能否影響腹膜的超濾功能呢?而有關尿酸致病的研究有很多報道，血尿酸水平與痛風發(fā)病率呈正相關；血清尿酸水平增高是影響中重度慢性心力衰竭患者預后的一項獨立的預測指標；尿酸可明顯促進VSMC細胞增殖；可溶性尿酸可以促進炎癥反應。但目前還不清楚尿酸是否參與腹膜間皮細胞的激活，從而產(chǎn)生炎癥、致纖維因表達，導致腹膜纖維化。鑒于上述原因，我們設想尿酸可介導腹膜間皮細胞的激活，此類研究尚未見報道。腹膜間皮細胞表達細胞因子、趨化因子

4、在腹膜炎及腹膜纖維化進展過程中起著十分重要的作用。目前尚無有效的解決辦法。過氧化物酶增殖物活化受體-γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPAR-γ)活化后具有抗炎效應。大鼠腹膜間皮細胞結構性表達PPAR-γ受體，受脂多糖(LPS)刺激后表達上調(diào)，PPAR-γ配體可顯著抑制LPS介導的CD40mRNA和ICAM-1蛋白的表達，提示PPAR-γ可能通過負性調(diào)節(jié)炎癥介質分泌而參與腹腔

5、局部防御。本研究擬通過建立體外培養(yǎng)的HPMC，分別不同濃度的尿酸刺激HPMC，觀察刺激后HPMC增殖、損傷；MCP-1、ILK(整合素連接激酶)、TGF-β1(轉化生長因子β1)表達變化。探討尿酸對人腹膜間皮細胞(HPMC)影響的作用及PPAR-γ受體激動劑對尿酸效應的干預。 第一部分：尿酸對腹膜間皮細胞(HPMC)增殖、損傷的影響 目的：觀察尿酸在體外對人腹膜間皮細胞(HPMC)增殖的影響。研究尿酸對HPMC作用的時間

6、-效應及劑量-效應關系、尿酸對HPMC的損傷作用，探討尿酸對HPMC的作用機制。 方法：1、細胞培養(yǎng)及分組：待生長狀況良好的HPMC株60-80％細胞貼壁后，無血清培養(yǎng)基同步24h，然后根據(jù)分組給予相應的刺激。HPMC給予不同濃度和時間尿酸刺激。2、指標檢測：采用MTT比色法檢測200、400、600、800、1000umol/L濃度的尿酸刺激24、48、72h后HPMC增殖情況；同時采用乳酸脫氫酶測定試劑盒，檢測培養(yǎng)液中乳酸脫

7、氫酶(LDH)水平，從而確定最佳尿酸濃度。 結果：1、與刺激前比較，尿酸在200～1000umol/L作用濃度范圍內(nèi)，抑制HPMC增殖；與對照組比較，不同程度地抑制HPMC增殖，隨尿酸濃度增高、作用時間延長，其抑制增殖作用明顯(P<0.05)，有統(tǒng)計學意義。2、與對照組比較，不同濃度的尿酸皆使HPMC培養(yǎng)液中LDH水平增高，尿酸在600～1000umol/L作用濃度范圍內(nèi)，LDH水平增高明顯，呈劑量、時間依賴效應，差異均有顯著性

8、(P<0.05)。 結論：尿酸能夠抑制HPMC細胞增殖、誘導HPMC損傷，呈劑量、時間依賴效應。 第二部分：羅格列酮對尿酸致腹膜間皮細胞(HPMC)增殖、損傷的干預作用 目的：觀察PPAR-γ激動劑羅格列酮對尿酸致腹膜間皮細胞(HPMC)增殖、損傷作用的影響。 方法：1、細胞培養(yǎng)及分組：待生長狀況良好的HPMC株60-80％細胞貼壁后，無血清培養(yǎng)基同步24h，采用15umol/L羅格列酮預處理細胞4小時后

9、，給予600umol/L尿酸不同作用時間(24、48、72h)進行干預。2、指標檢測：采用MTT比色法檢測HPMC增殖情況；采用乳酸脫氫酶測定試劑盒，檢測培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)水平。 結果：1、600umol/L，尿酸作用HPMC24、48、72h后，抑制HPMC增殖；與對照組比較，抑制增殖作用明顯(P<0.05)，有統(tǒng)計學意義；羅格列酮干預后，各不同時間點，尿酸對HPMC抑制作用減弱。2、600umol/L尿酸作用HPM

10、C24、48、72h后，HPMC培養(yǎng)液中LDH水平增高，與對照組比較，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；羅格列酮干預后，各不同時間點，HPMC培養(yǎng)液中LDH水平降低(P<0.05)。 結論：羅格列酮能夠降低尿酸對HPMC增殖抑制、損傷作用。 第三部分：羅格列酮對尿酸誘導腹膜間皮細胞(HPMC)表達炎癥因子的影響 目的：觀察600umol/L尿酸濃度在不同時間范圍內(nèi)(24、48、72h)誘導人HPMC表達炎癥因子MCP

11、-1，ILK(整合素連接激酶)，TGF-β1的作用。 方法：1、細胞培養(yǎng)及分組：待生長狀況良好的HPMC株60-80％細胞貼壁后，無血清培養(yǎng)基同步24h，將細胞分為對照組(只使用培養(yǎng)液)、尿酸組(培養(yǎng)液+600umol/L尿酸)、羅格列酮組(培養(yǎng)液+15umol/L羅格列酮)、尿酸+羅格列酮組(培養(yǎng)液+15umol/L羅格列酮+600umol/L尿酸)。干預組分別先采用15umol/L羅格列酮預處理細胞4小時，然后根據(jù)分組給予相

12、應的刺激。2、指標檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測HPMC上清液中MCP-1蛋白的濃度、采用Westernblot方法、熒光定量PCR技術檢測HPMC的ILK(整合素連接激酶)、TGF-β1蛋白和基因表達。 結果：1、尿酸刺激組細胞MCP-1的蛋白表達呈時間效應性，均較空白對照組顯著提高；2、HPMC在尿酸刺激下，ILK(整合素連接激酶)、TGF-β1的基因和蛋白表達于24、48、72h均較空白對照組顯著升高，但其基