過表達E-鈣粘蛋白對TGF-β誘導的腹膜間皮細胞轉分化的影響.pdf

1、目的：E-鈣粘蛋白(E-cadherin，E-cad)質粒(pIRES2-EGFP-ECAD)轉染人腹膜間皮細胞永生化細胞株（HMrSV5），觀察E-cad的過表達對腹膜間皮細胞上皮細胞-間充質轉分化(Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)的影響。
　　方法：⑴采用大腸桿菌DH5α進行pIRES2-EGFP-ECAD質粒及空白質粒(Vector)擴增，酶切鑒定，RT-PCR驗證。⑵體外培養(yǎng)HMr

2、SV5，將HMrSV5分為正常對照組、E-cad轉染組、空質粒轉染組，通過脂質體轉染法(lip LTX)轉染pIRES2-EGFP-ECAD質粒及空質粒，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學的變化;流式細胞術評估轉染效率，采用RT-PCR、Western Blot分別觀察轉染后12h、24h、36h、48h、72h E-cad的mRNA及蛋白表達。⑶將HMrSV5分為正常對照組、TGF-β刺激組，采用WesternBlot、細胞免疫熒光觀察TGF

3、-β刺激后12h、24h、36h、48h E-cad、α-SMA的蛋白表達;驗證TGF-β刺激對HMrSV5EMT的影響。⑷將HMrSV5分為正常對照組、TGF-β刺激組、pIRES2-EGFP-ECAD質粒轉染+TGF-β刺激組，通過脂質體轉染法(lip LTX)轉染pIRES2-EGFP-ECAD質粒，并分別給予TGF-β刺激，采用RT-PCR檢測轉染+刺激（或單純刺激）后12h、24h、36h、48h E-cadmRNA的表達，采

4、用Western Blot方法檢測轉染+刺激及單純刺激后12h、24h、36h、48hα-SMA、Vimentin的蛋白表達;采用細胞免疫熒光方法檢測轉染+刺激（或單純刺激）后12h、24h、36h、48h E-cad、α-SMA的蛋白表達，觀察E-cad的過表達對TGF-β誘導的HMrSV5EMT的影響。
　　結果：①擴增質粒經(jīng)限制性內切酶酶切電泳鑒定，RT-PCR證實，擴增質粒序列無突變。②pIRES2-EGFP-ECAD質粒

5、轉染HMrSV512h細胞內E-cadmRNA表達量最高，隨后逐步下降，與正常對照組比較有差異(p＜0.05)，轉染后12h細胞內E-cad表達開始上調，36小時達到峰值，隨后逐漸下降，與正常對照組及空質粒轉染組比較均有顯著差異(p＜0.01)。③TGF-β刺激HMrSV5后，細胞內α-SMA表達逐步上調，呈時間依賴性趨勢，與正常對照組相比有顯著差異(p＜0.01)。④轉染后+刺激組與單純刺激組比較，細胞內α-SMA、Vimentin表