TGF-β1 shRNA對人腹膜間皮細胞基質(zhì)合成和超微結構的影響.pdf

1、腹膜纖維化是腹膜透析主要的并發(fā)癥，也是導致腹膜透析技術性失敗的主要原因。腹膜纖維化的發(fā)生可使腹膜透析患者腹膜超濾效能下降和腹透中斷，嚴重時還可危及生命。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，腹膜細胞的損傷和伴隨的腹膜內(nèi)細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的積聚被認為是導致腹膜纖維化的關鍵因素，其中非生理性的腹透液及其產(chǎn)物、炎癥介質(zhì)、生長因子等共同促進這一過程。 大量的研究表明，TGF-β1的過度表達在腹膜纖維化纖維化機制中起

2、關鍵作用，因此也被視為治療腹膜纖維化最主要的靶目標。有研究證明抑制TGF-β1的過度表達或阻止其效應確實可減輕腹膜纖維化病變，包括使用一些藥物、抗體或反義核酸技術，但目前仍未找到一種較為理想的方法抑制腹膜細胞中TGF-β1的過度表達。 近年來RNA干擾(RNAi)技術的發(fā)現(xiàn)為我們提供了新的思路。RNA干擾是真核生物進化上的保守機制，在大多數(shù)真核生物包括人類都存在。RNA干擾表現(xiàn)為雙鏈RNA觸發(fā)導致序列特異性的mRNA降解。RNA

3、干擾能通過導入與目標基因具有同源序列的短雙鏈RNA(小干擾RNAs，siRNAs)或短發(fā)夾狀RNA(shRNA)介導序列特異性基因表達抑制。僅僅幾年前，生物學家還只能在植物或者線蟲中使用RNAi技術去獲取對于基因功能的更多了解，但是近幾年得到突破性進展，RNAi已在基因治療方得到了廣泛應用。由于RNAi技術本身的特性，從理論上來說可以可用來特異性抑制幾乎所有的基因，而TGF-β1在腹膜纖維化中的關鍵作用已被證實，因此，利用RNAi技術抑

4、制TGF-β1在腹膜細胞中的過度表達成為一種合理的選擇。 在前期研究中我們已經(jīng)構建了兩個表達TGF-β1shRNA的質(zhì)粒(pcDU6-A1-B1和pcDU6-A2-B2)，并在預實驗中初步證明了其抑制效應。本文中使用這兩種載體轉染人腹膜間皮細胞，研究其對于腹膜間皮細胞(HPMCs)TGF-β1的表達和細胞基質(zhì)合成的影響，以及HPMCs超微結構的變化。 目的：利用我們構建的TGF-β1shRNA表達載體轉染HPMCs，了解

5、其對于HPMCs在腹透液和高糖誘導下TGF-β1表達的抑制作用，以及對于HPMCs基質(zhì)合成的影響和超微結構的變化。 方法：體外培養(yǎng)腹膜間皮細胞株(HMrSV5)，使用不同濃度腹透液刺激，觀察shRNA表達載體轉染對于其TGF-β1表達的影響及超微結構的變化。HPMCs中TGF-β1mRNA的表達采用半定量RT-PCR檢測，培養(yǎng)液中TGF-β1蛋白質(zhì)水平采用雙抗夾心法ELISA檢測，透射電鏡觀察細胞超微結構。此外，體外培養(yǎng)原代HP

6、MCs，使用高糖刺激，觀察shRNA表達載體轉染對于其TGF-β1表達及FN、CollagenⅠ合成的影響，mRNA的表達采用半定量RT-PCR，培養(yǎng)液中TGF-β1和FN蛋白質(zhì)水平采用雙抗夾心法ELISA檢測，細胞內(nèi)FN和CollagenⅠ的蛋白質(zhì)水平采用Westernblot檢測。 結果：4.25％腹透液可使腹膜間皮細胞株(HMrSV5)TGF-β1表達明顯增高(p＜0.01)，而shRNA表達載體轉染組細胞TGF-β1表達

7、明顯被抑制(p＜0.01)，空載體轉染組與4.25％腹透液刺激組則無明顯差異(p＞0.05)；透射電鏡發(fā)現(xiàn)，轉染shRNA表達載體與轉染空載體的細胞相比在微絨毛減少和線粒體水腫程度上稍有減輕。高糖(50mmol/L)可使HPMCsTGF-β1表達明顯增高(p＜0.01)，F(xiàn)N和CollagenⅠ表達也增高(p＜0.01)，而shRNA表達載體轉染組細胞TGF-β1表達明顯被抑制(p＜0.01)，細胞內(nèi)外的FN和細胞內(nèi)的CollagenⅠ

8、蛋白表達也被明顯抑制(p＜0.01)，空載體轉染組與高糖刺激組相比無顯著差別(p＞0.05)。結論：4.25％腹透液可刺激HPMCsTGF-β1表達明顯增高； TGF-β1shRNA表達載體對于4.25％腹透液導致的HPMCs細胞株超微結構的改變可能具有一定的保護作用。高糖可刺激HPMCsTGF-β1、FN和CollagenⅠ表達明顯增高；TGF-β1shRNA表達載體可抑制腹透液和高糖誘導的HPMCsTGF-β1的高表達，并抑