肝素對高糖誘導的水通道蛋白在人腹膜間皮細胞上表達的影響.pdf

1、目的：水通道蛋白(aquaporin，AQP)是Agre等人于1988年分離紅細胞Rh血型抗原的一段32KD多肽的過程中無意得到的一段28KD的多肽，后來被證實為介導細胞內外水轉運的通道，在微生物、植物、哺乳動物中廣泛存在，并在多種器官的生理和病理中發(fā)揮重要作用。本研究旨在通過肝素對葡萄糖誘導體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細胞(human perotonealnesothelial cells，HPMCs)對AQP1、AQP3mRNA及蛋白表達的

2、影響。 方法：從連續(xù)不臥床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis，CAPD)治療的慢性腎臟病患者腹膜透析流出液中分離并培養(yǎng)人腹膜間皮細胞，第二代細胞應用免疫組化方法進行細胞鑒定，第三代細胞用于實驗，分別按照不同的實驗要求分成2.5％葡萄糖組、2.5％葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素組、2.5％葡萄糖加5×10-3mg/ml肝素組、2.5％葡萄糖加1.5×10-2mg/m

3、l肝素組。采用逆轉錄多聚酶鏈式反應(Reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)半定量分HPMCs中AQP1、AQP3mRNA的表達水平，采用免疫細胞化學法檢測HPMCs 上AQP1、AQP3的蛋白表達水平。 結果： 一、葡萄糖及肝素誘導腹膜間皮細胞AQP1、AQP3mRNA的影響1、用2.5％葡萄糖、2.5％葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素分別處理H

4、PMC不同時間后檢測，結果顯示葡萄糖可顯著誘導間皮細胞表達AQP1mRNA上調，并隨時間延長而增多，與無糖組比較具有顯著的統(tǒng)計學差異，且AQP1mRNA表達量在24小時最大(t=-53.576，P<0.01)。而葡萄糖組與葡萄糖加肝素組比較無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 2、用2.5％葡萄糖、2.5％葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素分別處理HPMC不同時間后檢測，結果顯示葡萄糖可顯著誘導間皮細胞表達AQP3mRNA上調

5、，并隨時間延長而增多，與無糖組比較具有顯著的統(tǒng)計學差異，且AQP3mRNA表達量在24小時最大(t=-43.743，P<0.01)。而葡萄糖組與葡萄糖加肝素組比較無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 3、用2.5％葡萄糖、2.5％葡萄糖加不同濃度的肝素(2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml、1.5×10-2mg/ml)分別處理HPMC 4小時后，檢測細胞表達AQP1mRNA的變化。結果顯示葡萄糖及葡萄糖加肝素組AQP

6、1mRNA表達均高于無糖組，有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)，但葡萄糖組與葡萄糖加2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素組比較無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)，而葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素組比葡萄糖組AQP1mRNA的表達量明顯增加(t=-37.676，P<0.05)。 4、用2.5％葡萄糖、2.5％葡萄糖加不同濃度的肝素(2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml、1.5×10-2mg/ml

7、)分別處理HPMC 4小時后，檢測細胞表達AQP3mRNA的變化。結果顯示葡萄糖及葡萄糖加肝素組AQP3mRNA表達均高于無糖組，有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)，但葡萄糖組與葡萄糖加2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素組比較無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)，而葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素組比葡萄糖組AQP3mRNA的表達量明顯增加(t=-30.578， P<0.05)。 二、葡萄糖及肝素誘導腹膜間皮

8、細胞AQP1、AQP3的影響免疫細胞化學結果顯示無糖組見棕黃色顆粒主要分布在胞漿和胞膜上；與無糖組比較，葡萄糖和葡萄糖加肝素組陽性表達明顯增加，胞核上亦可見棕黃色深染顆粒，有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.01)；AQP1蛋白表達在葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素組與葡萄糖組及葡萄糖加2.5×10-33mg/ml、5×10-3mg/ml肝素組比較，統(tǒng)計學分析有明顯差異(t=4.405，6.066，4.983，P<0.01)；AQP3蛋白表

9、達在葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素組與葡萄糖組及2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素組比較，統(tǒng)計學分析亦有明顯差異(t=3.412，5.484，3.667，P<0.01)；而葡萄糖組與葡萄糖加2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素組比較無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。葡萄糖組及葡萄糖加1.5×10-22mg/ml肝素組細胞免疫組化圖片可見胞核及胞漿有空泡樣變，而葡萄糖加常規(guī)劑量肝素組無明顯空泡