舒洛地特對高糖和脂多糖誘導(dǎo)下人腹膜間皮細(xì)胞纖維化的影響.pdf

1、背景：
　　近年來，持續(xù)性非臥床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis，CAPD)逐漸成為終末期腎臟病患者腎臟替代療法的一種重要手段。然而腹膜透析相關(guān)性腹膜炎和腹膜纖維化是腹膜透析治療的主要并發(fā)癥，最終導(dǎo)致腹膜功能衰竭，這是腹膜透析患者退出治療的主要原因。目前已知腹膜纖維化是由多種病因共同作用引起，如腹膜炎，含葡萄糖非生理性腹透液，糖基化終末產(chǎn)物，乳酸鹽等。脂多糖（lipopo

2、lysaccharide，LPS）為革蘭陰性桿菌的外膜組成部分，是全身炎癥反應(yīng)的重要觸發(fā)劑，也是腹膜透析并發(fā)腹膜炎時的重要病理損害因素。盡管以葡萄糖作為溶質(zhì)的腹透液存在諸多生理不相容性，但目前世界范圍仍以其作為主要的透析溶質(zhì)。
　　正常情況下，腹膜間皮細(xì)胞表面有一層機(jī)械防御屏障—糖萼圍繞著，一層由糖胺聚糖、蛋白聚糖和磷脂質(zhì)組成，它們一起形成光滑、無粘著的漿膜層保護(hù)腹膜避免磨損、感染和腫瘤傳播。糖萼是腹膜的第一道保護(hù)屏障。糖胺聚糖包

3、括4個結(jié)構(gòu)不同的成分:透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素或硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素和硫酸角質(zhì)素;蛋白聚糖主要由核心蛋白聚糖和二聚糖合成。國外文獻(xiàn)有報道，在體外研究人腹膜間皮細(xì)胞合成和分泌核心蛋白聚糖、二聚糖、基底膜聚糖和透明質(zhì)酸;在透析液中同時發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸、核心蛋白聚糖和二聚糖。本實(shí)驗選擇透明質(zhì)酸和核心蛋白聚糖觀察糖萼的變化，而國內(nèi)對人腹膜間皮細(xì)胞透明質(zhì)酸、核心蛋白聚糖的表達(dá)情況尚未檢索到相關(guān)文獻(xiàn)。
　　舒洛地特（SLX，肝素類似物）是目前臨床

4、上一種新的糖胺聚糖(glycosaminoglycans，GAGs)類制劑，它是一種相對低分子量的糖胺聚糖制劑，主要由80％的電泳中硫酸乙酰肝素及20％的硫酸皮膚素組成。SLX也是糖萼的一個組成成分。舒洛地特不僅具有抗凝、溶栓、抗心血管疾病、降血脂等作用，在糖尿病腎病治療中取得多方面的獨(dú)特療效:保護(hù)和重建血管損傷的血管內(nèi)皮;維持腎小球基底膜的電荷屏障;減少白蛋白通透等保護(hù)腎臟作用。因此，我們認(rèn)為外源性補(bǔ)充SLX對腹膜有一種保護(hù)作用。

5、r>　　目前腹膜纖維化確切發(fā)病機(jī)制仍不清楚，本實(shí)驗擬采用檢測HA、DCN觀察糖萼對腹膜間皮細(xì)胞的保護(hù)作用，在腹膜炎癥和纖維化指標(biāo)中選擇具有代表性的細(xì)胞因子—IL-6和TGF-β1，觀察SLX在炎癥及纖維化方面的作用。
　　目的：
　　本實(shí)驗擬采用檢測HA、DCN觀察糖萼對腹膜間皮細(xì)胞的保護(hù)作用，在腹膜炎癥和纖維化指標(biāo)中選擇具有代表性的細(xì)胞因子—IL-6和TGF-β1，觀察SLX在炎癥及纖維化方面的作用，進(jìn)而為防治腹膜透析相關(guān)

6、性腹膜纖維化提供一定的思路。
　　方法：
　　一、研究方法
　　人腹膜間皮細(xì)胞株生長于含10％胎牛血清、1640培養(yǎng)液（美國GIBCO）中，5％的CO2、37℃孵育培養(yǎng)增殖傳代，每天換液1次，待細(xì)胞融合達(dá)90％時用于試驗。
　　二、實(shí)驗分組
　　當(dāng)人腹膜間皮細(xì)胞達(dá)90％融合時進(jìn)入實(shí)驗。用含1％胎牛血清的1640培養(yǎng)基孵育24h同步化后隨機(jī)分為以下各組:
　　A對照組:只加1％胎牛血清的1640培養(yǎng)基<

7、br>　　B高糖組:
　?、贊舛冉M:1.5％，2.5％，4.25％葡萄糖作用48小時;
　　②時間組:2.5％葡萄糖作用不同時間（0，6，12，24，48，72小時）;
　　③SLX組:2.5％高糖+不同濃度舒洛地特（50μg/ml，400μg/ml，800μg/ml，1200μg/ml）作用48小時。
　　C脂多糖組:
　?、贊舛冉M:LPS1，10，100μg/ml作用48小時;
　?、跁r間組:LP

8、S10μg/ml作用不同時間（0，6，12，24，48，72小時）;
　?、跾LX組:LPS10μg/ml+不同濃度舒洛地特（50μg/ml，400μg/ml，800μg/ml，1200μg/ml）作用48小時
　　三、檢測及方法
　　ELISA法檢測透明質(zhì)酸(HA)，核心蛋白聚糖(DCN)，IL-6，TGF-β1。
　　四、統(tǒng)計學(xué)分析
　　全部數(shù)據(jù)采用SPSS21.0醫(yī)用軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料采用(

9、x)±s表示，組間比較采用單因素方差分析，p＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、細(xì)胞毒性實(shí)驗(MTT試驗)
　　不同濃度SLX（0μg/ml，50μg/ml，400μg/ml，800μg/ml，1200μg/ml，1600μg/ml）干預(yù)HPMCs48小時50μg/ml，400μg/ml，800μg/ml，1200μg/ml細(xì)胞死亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值＞0.05），1600μg/ml細(xì)胞死亡率差異有統(tǒng)計

10、學(xué)意義(P值＜0.05)，因此認(rèn)為本實(shí)驗中舒洛地特劑量對HPMCs無毒性。
　　二、高糖及脂多糖對HA蛋白表達(dá)的影響
　　（一）高糖對HPMCsHA蛋白表達(dá)的影響
　　與正常對照組相比，不同濃度的高糖組HPMCsHA上調(diào)，呈劑量依賴性，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在2.5％高糖不同時間作用下，HPMCsHA上調(diào)，6小時升高，12小時達(dá)到最高峰，72小時仍能檢測到HA，與0小時比較，組間均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0

11、5);不同濃度SLX組HA含量上調(diào)，與2.5％高糖組相比，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且隨著slx濃度的增加，HA的表達(dá)上調(diào)，1200μg/mlslx組下降。
　?。ǘ┲嗵菍PMCsHA蛋白表達(dá)的影響
　　與正常對照組相比，不同濃度的脂多糖組HPMCsHA上調(diào)，呈劑量依賴性，10和100μg/ml脂多糖組具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在10μg/ml脂多糖不同時間作用下，HPMCsHA上調(diào)，6小時升高，12

12、小時達(dá)到最高峰，72小時仍能檢測到HA，與0小時比較，組間均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);;不同濃度SLX48h組HA含量上調(diào)，與10μg/ml脂多糖組相比，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且隨著slx濃度的增加，HA的表達(dá)上調(diào)，1200μg/mlslx組下降。
　　三、高糖及脂多糖對DCN蛋白表達(dá)的影響
　?。ㄒ唬└咛菍PMCsDCN蛋白表達(dá)的影響
　　與正常對照組相比，不同濃度的高糖組HPMCsDCN蛋白

13、表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，呈劑量依賴性;在2.5％高糖不同時間作用下，HPMCsDCN蛋白表達(dá)上調(diào)，呈雙峰，分別為12小時和48小時達(dá)高峰，72小時仍能檢測到DCN，與0小時比較，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);不同濃度SLX48h組DCN含量上調(diào)，與2.5％高糖組相比，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　?。ǘ┲嗵菍PMCsDCN蛋白表達(dá)的影響
　　與正常對照組相比，不同濃度的脂多糖組HPMCsDCN上調(diào)，呈

14、劑量依賴性，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在10μg/ml脂多糖不同時間作用下，HPMCsDCN上調(diào)，呈雙峰，分別12小時和48小時達(dá)高峰，72小時仍能檢測到DCN，與0小時比較，組間均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);不同濃度SLX48h組DCN含量上調(diào)，與10μg/ml脂多糖組相比，除50μg/mlSLX組外，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　四、高糖及脂多糖對IL-6蛋白表達(dá)的影響
　?。ㄒ唬└咛菍M

15、CsIL-6蛋白表達(dá)的影響
　　與正常對照組相比，不同濃度的高糖組HPMCs IL-6蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，呈劑量依賴性;在2.5％高糖不同時間作用下，HPMCs IL-6蛋白表達(dá)上調(diào)，呈雙峰，分別6小時和48小時達(dá)高峰，與0小時比較，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與2.5％高糖組相比，不同濃度的SLX48h組IL-6蛋白表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　?。ǘ┲嗵菍PMCs IL-6蛋白表

16、達(dá)的影響
　　與正常對照組相比，不同濃度的脂多糖組HPMCs IL-6蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，呈劑量依賴性;在10μg/ml脂多糖不同時間作用下，HPMCs IL-6蛋白表達(dá)上調(diào)，呈雙峰，分別6小時和48小時達(dá)高峰，與0小時比較，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與10μg/ml脂多糖組相比，不同濃度的SLX48h組IL-6蛋白表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　五、高糖及脂多糖對TGF-β1蛋白表達(dá)的

17、影響
　?。ㄒ唬└咛菍PMCs TGF-β1蛋白表達(dá)的影響
　　與正常對照組相比，不同濃度的高糖組HPMCs TGF-β1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)，呈劑量依賴性;在2.5％高糖不同時間作用下HPMCs TGF-β1蛋白表達(dá)上調(diào)，呈時間依賴性，與0h相比，組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與2.5％高糖組相比，不同濃度的SLX組TGF-β1蛋白表達(dá)顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　?。ǘ?/p>

18、）脂多糖對HPMCs TGF-β1蛋白表達(dá)的影響
　　與正常對照組相比，不同濃度的脂多糖組HPMCsTGF-β1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)，呈劑量依賴性;在10μg/ml脂多糖不同時間作用下HPMCs TGF-β1蛋白表達(dá)上調(diào)，呈時間依賴性，與0h相比，組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與10μg/ml脂多糖組相比，不同濃度的SLX組TGF-β1蛋白表達(dá)顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：