低密度脂蛋白對高糖背景下人腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化和細胞外基質(zhì)蓄積的影響及其機制探討.pdf

1、腹膜透析是終末期腎病(ESRD)終末期腎病患者重要的治療措施。終末期腎病患者往往伴隨著脂代謝的紊亂,約30-70％透析患者的甘油三酯升高,腹透病人較血透患者高膽固醇血癥更為突出,通常表現(xiàn)為TC、LDL—C濃度升高,HDL-C降低。腹膜纖維化是腹透患者腹膜失功的重要原因,具體機制仍不清楚,最近研究認為腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化和細胞外基質(zhì)(ECM)的蓄積是腹膜纖維化病變最重要的兩個病變,葡萄糖、炎癥在其中發(fā)揮重要作用,但是目前還沒有關(guān)于脂質(zhì)在腹膜

2、間皮細胞轉(zhuǎn)分化、及后續(xù)的ECM蓄積和纖維化中作用的報告,具體機制也不清楚。
　　 研究目的
　　 1.觀察維持性腹膜透析患者血脂紊亂特點,觀察脂代謝紊亂與腹膜轉(zhuǎn)運狀態(tài)的關(guān)系和對間皮細胞功能的影響；2.明確人腹膜間皮細胞(HPMCs)是否能誘導(dǎo)表達LDL受體,并攝取LDL進入細胞內(nèi)；3.了解LDL對高糖背景下HPMCs轉(zhuǎn)分化的影響；4.了解LDL對高糖背景下HPMCs細胞外基質(zhì)蓄積的作用；5.探討PPARγ在LDL誘導(dǎo)HP

3、MCs轉(zhuǎn)分化和ECM蓄積中的作用。
　　 材料、方法及結(jié)果:
　　 一、終末期腎病腹膜透析患者脂質(zhì)代謝紊亂特點
　　 選擇2009年3月-9月在北京協(xié)和醫(yī)院透析中心規(guī)律腹膜透析(超過3月)的患者127例,維持性血透患者95例,對照組為同期門診和住院的慢性腎臟病(CKD3—4期)患者130例,隨訪2年觀察患者的死亡情況。收集患者的臨床資料、血生化、透析充分性、氮平衡和腹膜轉(zhuǎn)運特點,測定血脂和載脂蛋白全套(TC、TG

4、、LDL—C、HDL-C、Lp(a)、apoA、apoB)、高敏C反應(yīng)蛋白、腹透液CA125。隨診2年,分析脂質(zhì)代謝紊亂與腹透患者生存率、腹透液CA125和腹膜轉(zhuǎn)運特點的關(guān)系。結(jié)果:1.腹透患者脂代謝紊亂比血透患者顯著,TC、LDL—C、apoA、apoB均高于血透患者,且白蛋白更低、iPTH降低；2.盡管CA125與TG和TC相關(guān),自身前后對照相關(guān)性很好,但是未發(fā)現(xiàn)腹膜的轉(zhuǎn)運狀態(tài)與腹透液CA125相關(guān),也沒發(fā)現(xiàn)TC、TG和LDL與腹膜

5、轉(zhuǎn)運方式相關(guān)。
　　 二、LDL對HMCs轉(zhuǎn)分化、ECM蓄積的影響及其機制探討
　　 1.人腹膜間皮細胞株的培養(yǎng)和鑒定
　　 外購HMrSV5人腹膜間皮細胞株(HPMCs),采用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,常規(guī)細胞培養(yǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài),細胞未融合前表現(xiàn)為圓形、星形和多邊形,細胞融合后呈現(xiàn)鋪路石樣改變。免疫組化檢測細胞抗人角蛋白、抗人波形蛋白細胞漿染色陽性、抗人Ⅷ因子和

6、CD45抗原染色陰性,符合人腹膜間皮細胞特征。
　　 2.HPMCs通過LDL受體攝取LDL進入細胞內(nèi)
　　 免疫熒光觀察到LDL可以刺激HPMCs細胞表達LDL受體,主要表達在細胞膜上,少量在胞漿內(nèi)。油紅O染色法觀察到HPMCs能攝取LDL進入細胞內(nèi),細胞內(nèi)可見明顯的顆粒狀紅染脂滴,加入LDL受體阻斷劑乳鐵蛋白能抑制LDL進入細胞內(nèi),油紅O染色陰性。
　　 3.LDL對HPMCs轉(zhuǎn)分化的影響
　　 不同

7、濃度的LDL(0、25、50、100μ g/ml),刺激HPMCs24h后在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)隨LDL濃度增高,細胞間連接逐漸趨于松散,細胞呈現(xiàn)明顯梭形成纖維細胞樣形態(tài)。免疫熒光法觀察到對照組胞漿α—SMA陰性,隨LDL濃度增加,胞漿內(nèi)α—SMA熒光強度逐漸增強。HPMCs分為對照組、甘露醇組、葡萄糖30mmol/L組,葡萄糖120mmol/L組(HG組),HG+LDL組(100μ g/ml),RT—PCR(real

8、time—PCR)和免疫印跡法(Western blot)觀察α—SMA和E—cadherin mRNA和蛋白表達。HG+LDL能明顯上調(diào)α—SMA mRNA和蛋白表達,降低E—cadherin mRNA的表達。
　　 4.LDL對HPMCs細胞外基質(zhì)合成和降解的影響
　　 通過RT-PCR法觀察以上各組HPMCs膠原(COL-Ⅰ)和纖維連接蛋白(FN)mRNA表達,ELISA法測定細胞上清中COL-Ⅰ蛋白含量。HG+L

9、DL能明顯上調(diào)細胞上清中COL-Ⅰ蛋白的表達,COL-Ⅰ和FN在mRNA水平的檢測未觀察到各組間的顯著差異。RT—PCR法檢測到HG+LDL比對照組纖溶酶原抑制物(PAI-1)mRNA水平顯著增高,ELISA法檢測培養(yǎng)細胞上清PAI-1含量,HG+LDL組也顯著高于對照組。
　　 5.PPARγ在LDL誘導(dǎo)HPMCs轉(zhuǎn)分化和ECM蓄積影響中的作用
　　 RT—PCR和Western blot法分別檢測不同刺激組PPARγ

10、 mRNA和蛋白表達情況,HG+LDL能顯著上調(diào)PPARγ mRNA的表達。在以上研究中,加入不同濃度的GW9662(5μ g/ml、10μ g/ml),觀察到阻斷PPARγ配體能改善HG+LDL對HPMCs形態(tài)改變、轉(zhuǎn)分化和ECM降解酶抑制物PAI-1的作用。
　　 結(jié)論:
　　 在本實驗條件下,我們觀察到:
　　 1.腹膜透析患者脂代謝紊亂重于血透患者,主要表現(xiàn)為TC、LDL—C和apoB升高；