TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型的建立.pdf

1、背景和目的:上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelialtomesenchymaltransition,EMT)是一種分化完全的上皮細(xì)胞丟失其原有的表型而轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的一種特殊的生理病理過(guò)程,受多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素的調(diào)節(jié),其分子機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn),腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT在腎臟纖維化的發(fā)展中起著重要作用,可能是腎間質(zhì)纖維化(RIF)發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。RIF是多種慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同途徑。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β

2、1(tansforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的促纖維化因子,能夠誘導(dǎo)胚胎發(fā)育、組織纖維化和腫瘤的發(fā)生中的EMT。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(renaltubularepithelialcelltransdifferentiation,TEMT)是一個(gè)可逆的有序的發(fā)生過(guò)程,TGF-β1誘導(dǎo)的TEMT最早改變就是抑制E-cadherin表達(dá),E-cadherin的降低或不表達(dá)已成為細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的標(biāo)志。因此

3、,EMT以細(xì)胞和分子變化為特征,包括細(xì)胞間黏連和細(xì)胞極性的消失涉及黏著連接、緊密連接及細(xì)胞橋粒;上皮細(xì)胞角蛋白的下調(diào);間質(zhì)蛋白的上調(diào)如波形蛋白(VIM),在某些情況下還有平滑肌肌動(dòng)蛋白(ACTA2);為形成紡錘狀細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞骨架重構(gòu);涉及動(dòng)態(tài)的肌動(dòng)蛋白微絲的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲能力的增加;抗凋亡能力的增加。為了開(kāi)展EMT發(fā)生的分子機(jī)制研究,探討TGF-β1在人腎小管上皮細(xì)胞中促轉(zhuǎn)分化的作用,擬建立基于腎小管上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(TEMT

4、)細(xì)胞模型。方法:1.根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的基因序列,使用在線Primer-BLAST引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。采用RT-PCR方法檢測(cè)E-cadherin的表達(dá)變化,優(yōu)化TGF-β1作用濃度和作用時(shí)間。2.將實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組和TGF-β1處理組,利用TGF-β1(10ng/ml)處理實(shí)驗(yàn)組人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)24h,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。3.RealtimeRT-PCR、Westernblot和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)檢測(cè)E

5、MT相關(guān)的分子標(biāo)記。4.劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwellassay檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力。結(jié)果:1.成功設(shè)計(jì)PCR引物,根據(jù)E-cadherin基因表達(dá),優(yōu)化后得到TEMT中最佳時(shí)間點(diǎn)和濃度為TGF-β1(10ng/ml,24h)。2.構(gòu)建TGF-β1誘導(dǎo)的EMT體外細(xì)胞培養(yǎng)模型,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài):正常對(duì)照組細(xì)胞呈鵝卵石樣形態(tài);TGF-β1(10ng/ml)處理后細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)狀,細(xì)胞間緊密連接降低。3.RealtimeRT-PCR檢測(cè)

6、:TGF-β1處理組E-cadherin的表達(dá)水平降低,β-catenin的表達(dá)上調(diào)。Westernblot和免疫熒光檢測(cè):TGF-β1處理組E-cadherin表達(dá)減低,Vimentin表達(dá)增強(qiáng)。4.劃痕和Transwellassay法檢測(cè):TGF-β1處理組細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯增強(qiáng)。結(jié)論:1.E-cadherin、Vimentin和β-catenin、細(xì)胞遷移及侵襲能力是細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的分子標(biāo)志和特征。2.驗(yàn)證了TGF-β1在腎小管