PI3K-AKT通路在TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程中的作用和意義.pdf

1、目的：探討PI3K/Akt通路在TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞(humankidneyproximaltubularepithelialcellline，HKCs)間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程中的作用及意義。 方法：用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12(1：1)培養(yǎng)液將HKC細胞培養(yǎng)于24孔板或培養(yǎng)瓶中，細胞生長到約60-70％融合時，吸棄舊培養(yǎng)基，換成無血清(freeserummedium，F(xiàn)SM)同步饑餓12小時，然后分組如下

2、：①對照(C)組：用FSM培養(yǎng)細胞；②不同濃度TGF-β1(T)組：分別用TGF-β15、10、15、20ng/mL培養(yǎng)細胞，分為T5、T10、T15、T20四組；③TGF-β1+PI3K抑制劑wortmannin組(T+W)：采用10ng/mLTGF-β1+10nmol/Lwortmannin培養(yǎng)細胞。相差顯微鏡觀察HKC細胞的形態(tài)變化；免疫印跡(westernblot)測定總Akt(t-Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、α-平滑

3、肌肌動蛋白(α-smoothmusleactin，α-SMA)和E-鈣黏素(E-Cadherin)蛋白表達，選取免疫細胞化學(xué)法或間接免疫熒光法檢測p-Akt、α-SMA以及E-Cadherin表達；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法測定α-SMA和E-CadherinmRNA水平；Akt磷酸化水平用磷酸化Akt與總Akt水平的比值表示。 結(jié)果：1、細胞形態(tài)觀察：①C組：腎小管上皮細胞呈卵石樣緊密排列生長；②T組：T10、T

4、15、T20組細胞出現(xiàn)顯著的形態(tài)改變，表現(xiàn)為細胞間隙增大，細胞長短徑比例增加，細胞呈梭形，部分細胞和附近的細胞脫離接觸，失去卵石樣形態(tài)；T5組細胞部分呈現(xiàn)梭形，細胞長短徑比例略有增加但較前三組為小；③T+W組：T+W組細胞呈卵圓形，與C組細胞形態(tài)相似。 2、TGF-β1對PI3K/Akt通路的作用：Western印跡結(jié)果顯示：正常HKCs細胞蛋白水平的p-Akt幾無表達，加入10ng/m1TGF-β1刺激0.5小時后，磷酸化Ak

5、t水平即顯著增加(P＜0.05)，1小時升至頂峰，后磷酸化Akt水平隨時相而逐漸下降。另外TGF-β1濃度梯度實驗也顯示，隨著TGF-β1濃度升高，人腎小管上皮細胞中p-Akt水平也逐漸升高，與正常組比較均具有顯著差異(P＜0.05)。 3、wortmannin對TGF-β1激活PI3K/Akt通路的影響：①間接免疫熒光：正常HKC細胞(C組)FITC染色未見明顯綠色熒光。TGF-β1(10ng/mL)誘導(dǎo)后細胞胞漿中FITC染

6、色可見耀眼的熒光。T+W組細胞FITC染色與C組相同未見明顯熒光。②Western印跡結(jié)果進一步證實：正常HKCs細胞經(jīng)10ng/mlTGF-β1刺激后磷酸化Akt水平顯著升高(P＜0.05)，但同時加用wortmannin10nmol/L后，磷酸化Akt水平較TGF-β1組顯著減弱，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 4、E-cadherin表達水平的檢測 ①免疫細胞化學(xué)：正常HKCs細胞免疫細胞化學(xué)染色呈陽性，T1

7、0組細胞中未見棕色沉淀，AODE-cadherin與C組細胞比較顯著減弱(P＜0.05)；而T+W組E-cadherin染色呈陽性，AODE-cadherin較T10組表達顯著升高(P＜0.05)；②間接免疫熒光：正常HKC細胞表達E-cadherin，可見明亮的熒光染色，分布在胞膜上。10ng/mLTGF-β1誘導(dǎo)48h后，胞膜幾乎不見E-cadherin熒光染色，而與10nmol/Lwortmannin共孵育，胞膜可見明亮的熒光染色

8、。③RT-PCR：RT-PCR顯示在C組及T+W組可見E-cadherinmRNA擴增帶，但T10組只見內(nèi)參GAPDH條帶未見E-cadherin擴增帶，ROD結(jié)果T10組較C組及T+W組均顯著下降；④Westernblot：正常HKCs細胞有基礎(chǔ)蛋白水平的E-cadherin表達，加入10ng/mlTGF-β1刺激0.5小時后，E-cadherin水平即顯著下降(P＜0.05)，同時加用wortmannin10nmol/L組(T+W組

9、)，IODE-cadherin較T10組顯著升高(P＜0.05)。5、α-SMA表達水平的檢測 ①免疫細胞化學(xué)：C組及T+W組α-SMA染色呈陰性，TGF-β1誘導(dǎo)后細胞染色呈陽性，AODα-SMA值C組、T+W組較T10組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；②免疫熒光：正常HKC細胞幾不表達a-SMA，未見熒光染色。TGF-β1誘導(dǎo)細胞表達a-SMA，細胞可見耀眼的熒光染色，主要分布在胞漿中。而T+W組處理的HKC細

10、胞中未見熒光染色；③RT-PCR：C組及T+W組均僅見450bp的GAPDH擴增帶，未見a-SMAmRNA擴增帶，TGF-β1誘導(dǎo)了HKC細胞中a-SMAmRNA的表達，RT-PCR結(jié)果可見326bpa-SMAmRNA擴增帶，ROD值T組與C組、T+W組有顯著性差異(P＜0.05)。④westernblot：正常體外培養(yǎng)的HKCs幾無α-SMA蛋白表達，10ng/mLTGF-β1(T組)誘導(dǎo)48h后α-SMA蛋白顯著增加(P＜0.05)

11、，同時加用wortmannin10nmol/L組(T+W組)，與T組比較α-SMA蛋白表達明顯抑制(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.TGF-β1能誘導(dǎo)HKC細胞中PI3K/Akt通路激活； 2.PI3K/AKT通路參與TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程，PI3K/AKT是TGF-β1誘導(dǎo)EMT信號傳導(dǎo)途徑中的下游因子之一； 3.特異性阻斷PI3K/AKT通路的激活可有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HKCs的EMT過程。