Egr-1在缺氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　腎臟纖維化是各類慢性腎臟?。–hronickidneydisease,CKD）進(jìn)展至終末期腎病的共同通路。其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制是腎臟病學(xué)界研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。近年來，慢性缺氧在腎纖維化中的重要作用引起廣泛關(guān)注。已有研究表明，腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（Epithelial-to-masenchymaltransition，EMT）是慢性缺氧導(dǎo)致腎小管損傷進(jìn)而發(fā)生纖維化的主要機(jī)制之一。雖然已有研究發(fā)現(xiàn)了一些參與慢性缺氧

2、導(dǎo)致腎小管損傷的相關(guān)分子，如Twist、BVR、URG11、CTGF、HIF-1α，但針對這些分子的干預(yù)措施并不能有效抑制小管間質(zhì)損傷及其纖維化的進(jìn)展。這提示，參與這一病理過程的具體分子機(jī)制仍未完全闡明。因此，深入探討慢性缺氧誘導(dǎo)EMT的分子機(jī)制，對臨床有效的防治腎臟纖維化具有重要意義。
　　【目的】
　　探討早期生長反應(yīng)因子-1（Earlygrowthresponsefactor-1,Egr-1）在缺氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞

3、轉(zhuǎn)分化中的作用及分子機(jī)制，為臨床防治腎臟纖維化提供新的理論依據(jù)。
　　【方法】
　?。?）采用5/6腎臟次全切除術(shù)建立大鼠慢性腎臟纖維化模型，造模成功后，免疫組化法檢測大鼠腎組織中Egr-1、E-cadherin、Fsp-1、Snail的表達(dá)。收集臨床IgA腎病(leeⅢ-)Ⅳ患者腎組織標(biāo)本，以癌旁正常腎組織作為對照，免疫組化法檢測Egr-1、E-cadherin、Fsp-1、Snail的表達(dá)。（2）缺氧處理腎小管上皮細(xì)胞株

4、HK-2，分別用免疫熒光染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot檢測缺氧不同時(shí)間點(diǎn)后Egr-1的表達(dá)變化；（3）用pcDNA3.1,pcDNA3.1-Egr-1轉(zhuǎn)染HK-2，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，Westernblot檢測Egr-1及轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物E-cadherin、Fsp-1的表達(dá)變化；用siEgr-1、psilencer3.1轉(zhuǎn)染HK-2，再缺氧處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用Westernblot檢測Egr-1、E-cadherin、

5、Fsp-1的表達(dá)變化；（4）分別用PKC、ERK信號(hào)通路抑制劑calphostinC、PD98059處理HK-2，后缺氧1小時(shí)，Westernblot檢測缺氧前后PKC、pERK、ERK、Egr-1的表達(dá)變化；（5）缺氧處理HK-2，分別用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot檢測缺氧后Egr-1、Snail、E-cadherin、Fsp-1mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化；用siEgr-1、psilencer3.1轉(zhuǎn)染HK-2，Wes

6、ternblot檢測Egr-1、Snail、E-cadherin、Fsp-1mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化。
　　【結(jié)果】
　?。?）與假手術(shù)組相比，5/6腎臟次全切除大鼠腎小管上皮細(xì)胞高表達(dá)Egr-1，上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin表達(dá)減弱、間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白Fsp-1表達(dá)增強(qiáng)，轉(zhuǎn)分化相關(guān)蛋白Snail表達(dá)增強(qiáng)，提示腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，且轉(zhuǎn)分化表型與Egr-1過表達(dá)共存。（2）與癌旁正常腎組織相比，IgA腎病患

7、者腎小管上皮細(xì)胞Egr-1表達(dá)增強(qiáng)，E-cadherin表達(dá)減弱、Fsp-1表達(dá)增強(qiáng)，Snail表達(dá)增強(qiáng)。這與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，提示：慢性腎臟病患者腎組織中也同樣存在轉(zhuǎn)分化及Egr-1的高表達(dá)。（3）HK-2經(jīng)缺氧刺激不同時(shí)間后，Egr-1mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高，且具有時(shí)間依賴性。（4）與轉(zhuǎn)染空載體相比，HK-2細(xì)胞過表達(dá)Egr-1后，上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin表達(dá)減弱，成纖維細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Fsp-1表達(dá)增強(qiáng)（P＜0

8、.05），且細(xì)胞形態(tài)由典型的上皮細(xì)胞形態(tài)--卵圓形，轉(zhuǎn)變成間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)--梭形；而用小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）干擾掉Egr-1的表達(dá)后再缺氧處理HK-2，其轉(zhuǎn)分化表型得到逆轉(zhuǎn)。這提示Egr-1參與調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。（5）與單純?nèi)毖?小時(shí)組相比，用calphostinC阻斷PKC并缺氧1小時(shí)后，PKC、pERK、Egr-1表達(dá)減弱，而用PD98059阻斷ERK表達(dá)并缺氧1小時(shí)后，PKC表達(dá)

9、無明顯差異，pERK、Egr-1表達(dá)減弱（P＜0.05）。這提示缺氧通過PKC/ERK1/2信號(hào)通路誘導(dǎo)Egr-1高表達(dá)。（6）缺氧處理HK-2后，Egr-1、SnailmRNA及蛋白表達(dá)水平增高，E-cadhiern表達(dá)減弱、Fsp-1表達(dá)增強(qiáng)；而用siRNA干擾掉Egr-1的表達(dá)后，與空載體組及親本細(xì)胞組相比，Snail表達(dá)減弱，E-cadherin表達(dá)增強(qiáng)，F(xiàn)sp-1表達(dá)減弱，轉(zhuǎn)分化表型得到逆轉(zhuǎn)，提示：Egr-1可能通過上調(diào)Sna