整合素連接激酶在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用.pdf

1、研究背景： 腎間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同通路和最終結(jié)局，是由于基質(zhì)蛋白合成增加、降解減少，單核/巨噬細(xì)胞系浸潤，以及致纖維化的細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)等多種因素綜合作用的結(jié)果，其病理主要表現(xiàn)為間質(zhì)內(nèi)大量基質(zhì)蛋白積聚和成纖維細(xì)胞的增殖。已有證據(jù)表明，腎小管上皮細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子，影響細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成，以及轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞而參與間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展。其中腎小管上皮細(xì)胞．肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epitheli

2、al—mesenchymal transition，EMT)及其導(dǎo)致的ECM的過度積聚是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的重要原因。 EMT在慢性腎臟病(CKD)的發(fā)展過程中受到多種生長因子、細(xì)胞因子、激素和細(xì)胞外信號(hào)的調(diào)節(jié)，其中轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor—β1，TGF—β1)是被公認(rèn)的一種促纖維化因子，也是最強(qiáng)的誘導(dǎo)因子，在EMT過程中發(fā)揮重要作用。多種刺激因素如缺血、缺氧、梗阻、高糖等均可誘導(dǎo)T

3、GF—β1的產(chǎn)生，其可單獨(dú)引起并完成整個(gè)EMT過程，進(jìn)而導(dǎo)致間質(zhì)纖維化。但TGF—β1引起腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷與轉(zhuǎn)分化的具體機(jī)制尚未完全明確，至今也尚未找到有效的阻斷措施。 已有研究證實(shí)，整合素連接激酶(intergrin—linke kinase，ILK)是TGF—β1發(fā)揮作用的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路。ILK作為潛在的TGF—β1/Sma下游效應(yīng)因子，是否參與腎小管EMT并發(fā)揮關(guān)鍵作用？通過阻斷或抑制ILK的作用，能否阻止腎小管細(xì)

4、胞的炎癥損傷與轉(zhuǎn)分化，從而有效地阻斷或抑制腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展？ 肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是近年發(fā)現(xiàn)的在細(xì)胞損傷時(shí)的一個(gè)重要細(xì)胞再生和保護(hù)因子。但HGF能否阻斷TGF—β1誘導(dǎo)的EMT，效果及機(jī)制如何？其作用位點(diǎn)在何處？目前尚不清楚。如果能夠明確其作用機(jī)制及作用位點(diǎn)，進(jìn)一步明確ILK在EMT中的作用及機(jī)制，對(duì)阻斷甚至逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展過程將有重要意義。 研究目的：

5、 探討ILK在TGF—β1介導(dǎo)的腎小管EMT過程中的作用和機(jī)制，明確HGF在阻斷TGF—β1介導(dǎo)EMT的作用及其位點(diǎn)。通過本實(shí)驗(yàn)，旨在進(jìn)一步探討及闡明腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制，尋找腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展中的生物標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)，為CKD進(jìn)行性發(fā)展的防治提供重要理論依據(jù)和新的思路。 材料與方法： 1.體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK—2)。 2.采用不同濃度的TGF—β1刺激體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞(HK—2

6、)，誘導(dǎo)HK—2細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，光鏡下觀察HK—2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，并用Wsternblotting和Real—time RT—PCR方法檢測(cè)ILK的蛋白和mRNA表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)α—平滑肌肌動(dòng)蛋白(α—smooth muscle actin，α—SMA)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和E鈣粘蛋白(E—cadherin)的表達(dá)。 3.將培養(yǎng)的HK—2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、TGF—β1(20ng/ml)刺激組和HGF

7、(20ng/ml)干預(yù)組。通過應(yīng)用HGF干預(yù)ILK的作用，應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)ILK、α—SMA的蛋白表達(dá)量，Real—time RT—PCR法檢測(cè)ILK、α—SMA、FN、E—cadherin mRNA表達(dá)的改變。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用Spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one—way ANOVA)，多個(gè)樣本均數(shù)兩兩之間的比較采用LSD—t檢驗(yàn)，兩變量之間的關(guān)系采用直

8、線相關(guān)回歸分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：在光鏡下觀察，正常狀態(tài)下HK—2細(xì)胞呈圓形或者卵圓形，細(xì)胞間連接緊密。在TGF—β1刺激組，HK—2細(xì)胞逐漸變長，呈梭形，細(xì)胞間連接較前松散。隨著孵育時(shí)間的增加，細(xì)胞形態(tài)更趨梭形，且梭形細(xì)胞比例更大。而在加入HGF的干預(yù)組，大部分HK—2細(xì)胞呈圓形或者卵圓形，細(xì)胞間連接較緊密；但尚可見少量梭形細(xì)胞，其數(shù)目較TGF—β1刺激組明顯減少。

9、 2.Western blotting檢測(cè)結(jié)果：正常HK—2細(xì)胞僅表達(dá)極微量的ILK和α—SMA。TGF—β1可呈濃度依賴性方式刺激HK—2細(xì)胞表達(dá)ILK和α—SMA。在TGF—β1刺激組，ILK和α—SMA表達(dá)顯著增加(與對(duì)照組比較，P<0.001)；在HGF干預(yù)組，ILK和α—SMA蛋白表達(dá)量較TGF—β1刺激組明顯降低(P<0.001)，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)。 3.Real—time RT—PCR檢測(cè)結(jié)果：正常H

10、K—2細(xì)胞僅表達(dá)極微量的ILKmRNA、α—SMA mRNA和FN mRNA，但表達(dá)較為豐富的E—cadherin mRNA。TGF—β1也呈濃度依賴性刺激HK—2細(xì)胞表達(dá)ILK、α—SMA和FNmRNA。在TGF—β1刺激組，ILK、α—SMA和FNmRNA表達(dá)量明顯升高(P<0.001)，而E—cadherin mRNA表達(dá)量明顯減少(P<0.001)；在HGF干預(yù)組，ILK、α—SMA和FNmRNA表達(dá)量較TGF—β1刺激組明顯降

11、低(P<0.001)，但仍高于正常對(duì)照組(P<0.001)；E—cadherin mRNA表達(dá)量較TGF—β1刺激組明顯升高，但仍低于正常對(duì)照組(P<0.001)。 4.相關(guān)分析： ILK蛋白和mRNA的表達(dá)量與TGF—β1的濃度呈正相關(guān)(r=0.886，r=0.888，P<0.01)；ILK蛋白和mRNA的表達(dá)量與a—SMA蛋白和mRNA的表達(dá)量也呈正相關(guān)(r=0.940，r=0.926，P<0.01)：在mRNA水平上，IL

12、K mRNA表達(dá)量與FN mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.915，P<0.01)，而與E—cadherin mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(F=—0.820，P<0.01)。 結(jié)論： 1.TGF—β1呈濃度依賴性方式通過ILK誘導(dǎo)HK—2細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化及產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)。在此過程中，ILK蛋白和mRNA的表達(dá)量顯著增加。 2.應(yīng)用HGF可以部分阻斷或抑制ILK的表達(dá)，從而起到抑制TGF—β1誘導(dǎo)腎小管EMT的作用。