PI3K-Akt信號通路在食管鱗癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,其浸潤轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后差、死亡率高的關(guān)鍵因?yàn)?。惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移過程是一個多基因多信號通路參與調(diào)節(jié)的復(fù)雜的分子過程,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的重要的和必要的起始步驟。在EMT過程中,上皮細(xì)胞失去極性,細(xì)胞丟失E-cadherin、ZO-1(緊密連接蛋白)等上皮性標(biāo)志,獲得vimentin(波形蛋白)、fibronec

2、tin(纖維連接蛋白)等間質(zhì)性標(biāo)志,同時細(xì)胞的侵襲能力和運(yùn)動能力增強(qiáng)。
　　 Akt,也被稱為蛋白激酶B,是一種進(jìn)化上十分保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶,在PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路中起關(guān)鍵作用。哺乳動物細(xì)胞中的Akt有三種亞型,Akt1、Akt2和Akt3。在生長因子等細(xì)胞外生長信號的刺激下,細(xì)胞表面的受體酪氨酸激酶激活并活化PI3K產(chǎn)生PIP3(磷脂酰-3-磷酸肌醇),進(jìn)而使Akt發(fā)生磷酸化活化,調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及蛋白合成,

3、并參與血管形成,腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移等過程。除了影響細(xì)胞的增殖和凋亡,Akt還能夠通過磷酸化糖原合成酶-3(GSK-3β)來上調(diào)Snail(E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制子)的表達(dá),促使EMT的發(fā)生。在胃癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等惡性腫瘤中都存在著Akt的異常高表達(dá),但有關(guān)食管鱗癌組織中Akt的表達(dá)與食管鱗癌EMT的關(guān)系,國內(nèi)外的報道較少。
　　 轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-

4、β)是一種多效能的細(xì)胞因子,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等一系列細(xì)胞進(jìn)程。除此以外,TGF-β可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞發(fā)生EMT,是目前已知的EMT的主要誘導(dǎo)子,它不僅能夠誘導(dǎo)生長發(fā)育和創(chuàng)傷愈合中生理性EMT的發(fā)生,還能夠誘導(dǎo)纖維化和腫瘤進(jìn)程中.病理性EMT的發(fā)生。
　　 為探討食管鱗癌中PI3K/Akt信號通路與EMT的關(guān)系,本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測了食管鱗癌組織及正常食管粘膜中Akt、p-Akt和E-cadherin蛋白的表達(dá)

5、情況；以食管鱗癌細(xì)胞EC9706為研究對象,采用RNA干擾技術(shù)特異性地阻抑Akt的表達(dá),并以外源性的TGF-β1刺激,探討RNA干擾、TGF-β1刺激以及刺激與干擾聯(lián)合作用對Akt表達(dá)的影響,觀察食管鱗癌細(xì)胞EC9706中E-cadherin和vimentin表達(dá)的改變,以及對細(xì)胞侵襲能力的影響,并觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　 材料和方法：
　　 1.采用免疫組織化學(xué)SP法檢測80例食管鱗癌組織及80例正常食管粘膜組織中A

6、kt、p-Akt和E-cadherin蛋白的表達(dá):
　　 2.Akt siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞EC9706
　　 2.1倒置顯微鏡下觀察Akt基因沉默后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；
　　 2.2 RT-PCR、Western-blot法分別檢測轉(zhuǎn)染Oh(轉(zhuǎn)染前)、24h、48h、72h后細(xì)胞中Akt、E-cadherin、vimentin的mRNA及蛋白的表達(dá)；
　　 2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力的變化;

7、r>　　 2.4 Boyden chamber侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲力的變化。
　　 3.以外源性TGF-β1作用于食管鱗癌細(xì)胞EC9706
　　 3.1倒置顯微鏡下觀察TGF-β1或TGF-β1與Akt siRNA聯(lián)合作用下細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；
　　 3.2 RT-PCR、Western-blot法分別檢測在TGF-β1及TGF-β1與Akt siRNA聯(lián)合作用下Akt、E-cadherin、vimentin

8、的mRNA及蛋白的表達(dá)；
　　 3.3 Boyden chamber侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測在TGF-β1及TGF-β1與Akt siRNA聯(lián)合作用下細(xì)胞侵襲力的改變；
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料計(jì)算陽性率,陽性率之間的比較采用x2檢驗(yàn)(Chi-square),相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法進(jìn)行分析；計(jì)量資料用(X)±S表示,兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)(t-test),兩組以

9、上均數(shù)的比較用方差分析(ANVOA)。以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫組化結(jié)果:
　　 1.1食管鱗癌組織中Akt蛋白的陽性表達(dá)率為72.5％,明顯高于正常食管粘膜(32.5％)(P<0.01)；p-Akt蛋白的陽性表達(dá)率為81.3％,顯著高于正常食管粘膜組織(15.0％)(P<0.01)；E-cadherin蛋白的陽性表達(dá)率為33.8％,明顯低于正常食管粘膜(86.3％)(P<0.01)

10、；
　　 1.2 Akt蛋白的表達(dá)隨食管鱗癌組織分化程度的降低而不斷增加(P<0.05),其中高分化者為47.4％,中分化者為70.0％,低分化者為100％;浸潤淺層者Akt蛋白的陽性表達(dá)率為43.8％,較浸潤深層者(79.7％)差異顯著(P<0.05),同時有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組之間的差別也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(90.0％vs66.7％,P<0.05);p-Akt蛋白在高分化食管鱗癌組織中的表達(dá)為68.4％,在中分化者中為80

11、.0％,低分化者中為95.2％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在高分化食管鱗癌組織中E-cadherin蛋白的陽性表達(dá)率為57.9％,中分化者中為35.0％,低分化者中為9.5％,差異顯著(P<0.05)；隨食管鱗癌組織浸潤深度的增加,E-cadherin蛋白的表達(dá)不斷降低(P<0.05),浸潤淺層者為56.3％,浸潤深層者為28.1％;
　　 1.3在食管鱗癌組織中,Akt蛋白與p-Akt蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)

12、關(guān)系(P<0.05),E-cadherin蛋白的陽性表達(dá)與Akt和p-Akt的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。
　　 2.Akt siRNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 2.1形態(tài)學(xué)改變:轉(zhuǎn)染Akt siRNA后部分細(xì)胞皺縮,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞內(nèi)顆粒增多,折光性降低,細(xì)胞碎片增多；
　　 2.2 RT-PCR結(jié)果:除0h組以外,干擾后24h、48h、72h干擾組Akt mRNA的表達(dá)量(0.794±0.043、0.

13、601±0.059、0.414±0.040)與同時間點(diǎn)空白對照組(0.862±0.022、O.859±0.089、0.867±0.100)、空脂質(zhì)體組(0.914±0.051、0.899±0.036、0.945±0.071)及陰性對照組(0.885±0.070、0.871±0.055、0.895±0.033)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),且隨著干擾時間的延長,AktmRNA的表達(dá)逐漸降低(P均<0.05)；除0h組以外,干擾

14、組E-cadherin mRNA的表達(dá)量24h(1.150±0.102)、48h(1.388±0.073)及72h(1.623±0.138)與同時間點(diǎn)空白對照組(0.775±0.043、0.724±0.084、0.769±0.056)、空脂質(zhì)體組(0.732±0.078、0.769±0.047、0.743±0.082)及陰性對照組(0.768±0.026、0.729±0.085、0.718±0.064)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.

15、05),隨著干擾時間的延長,E-cadherin mRNA的表達(dá)逐漸升高(P均<0.05)；干擾組vimentin mRNA的表達(dá)量在48h(1.234±0.048)及72h(1.052±0.033)均高于同時間點(diǎn)空白對照組(1.390±0.009、1.387±0.017)、空脂質(zhì)體組(1.391±0.032、1.382±0.023)及陰性對照組(1.389±0.034、1.399±0.036),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),在干

16、擾組中,48h較Oh(1.409±0.032)及24h(1.397±0.037)均有顯著差異,72h較48h有顯著差異(P均<0.05)；
　　 2.3 Western-blot結(jié)果:干擾后Akt蛋白的表達(dá)從48h開始(48h:0.555±0.045、72h:0.356±0.043),與同時間點(diǎn)空白對照組(0.705±0.022、0.692±0.054)、空脂質(zhì)體組(O.704±0.036、0.711±0.028)及陰性對照組(

17、0.694±0.111、0.689±0.077)相比顯著下降(P<0.05),在干擾組中72h與48h之間具有顯著差異(P<0.05)；轉(zhuǎn)染后,E-cadherin蛋白的表達(dá)量逐漸升高,48h與24h相比(0.455±0.057 vs0.309±0.072)差異有顯著性(P<0.05),72h與48h之間也具有顯著性差異(0.620±0.041 vs0.455±0.057,P<0.05),且48h與72h時與同時間點(diǎn)空白對照組(0.30

18、7±0.023、0.316±0.065)、空脂質(zhì)體組(0.299±0.017、0.302±0.040)及陰性對照組(0.305±0.032、0.314±0.024)相比差異明顯(P<0.05);隨著干擾時間的延長,vimentin蛋白的表達(dá)量逐漸降低(0.563±0.034、0.447±0.034、0.356±0.043),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),同時間點(diǎn)干擾組與空白對照組(0.696±0.030、0.704±0.039、

19、0.681±0.046)、空脂質(zhì)體組(0.709±0.041、O.718±0.050、0.715±0.021)及陰性對照組(0.700±0.039、0.712±0.022、0.698±0.041)相比vimentin蛋白的表達(dá)有顯著區(qū)別(P均<0.05)；2.4 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果:轉(zhuǎn)染后干擾組細(xì)胞的增殖水平較同時間點(diǎn)各對照組(空白對照組、空脂質(zhì)體組及陰性對照組)降低,其中48h、72h時,干擾組(0.746±0.025、0.823±0.0

20、11)與同時間點(diǎn)空白對照組(0.860±0.032、1.026±0.076)、空脂質(zhì)體組(0.834+0.025、1.042±0.106)及陰性對照組(0.838±0.033、1.003±0.010)之間有顯著性差異(P均<0.05)；
　　 2.5體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果:干擾后細(xì)胞的體外侵襲能力逐漸下降(89.80±6.98、68.80±10.43、47.60±8.32),48h與24h相比差異有顯著性,72h與48h相比差異有顯著

21、性(P均<0.05),同時,在48h和72h時,干擾組與空白對照組(97.40±4.72、88.00±7.65)、空脂質(zhì)體組(93.00±10.49、92.4±13.18)及陰性對照組(85.80±5.40、90.60±5.13)之間穿膜細(xì)胞數(shù)有顯著性差異(P均<0.05)。
　　 3.TGF-β1刺激食管鱗癌細(xì)胞EC9706;
　　 3.1形態(tài)學(xué)改變:TGF-β1作用后部分細(xì)胞體積增大,細(xì)胞伸長,由多邊形向長梭形轉(zhuǎn)變,

22、并且細(xì)胞排列松散,細(xì)胞間隙增寬；TGF-β1與Akt siRNA聯(lián)合作用下部分細(xì)胞皺縮,細(xì)胞內(nèi)顆粒增多,折光性降低,細(xì)胞碎片增多；
　　 3.2 RT-PCR結(jié)果:在TGF-β1的作用下,Akt mRNA及vimentin mRNA的表達(dá)量較空白對照組明顯升高(1.007±0.173 vs0.801±0.032,0.687±0.134 vs0.542±0.073),E-cadherin mRNA的表達(dá)量較空白對照組明顯下降(0.

23、452±0.122 vs0.661±0.060)(P均<0.05)；在TGF-β1與Akt siRNA聯(lián)合作用下,Akt mRNA及vimentin mRNA的表達(dá)較TGF-β1單獨(dú)作用組明顯下調(diào)(0.681±0.073 vs0.854±0.071,0.475±0.083 vs0.706±0.078),E-cadherin mRNA的表達(dá)較TGF-β1單獨(dú)作用組明顯上調(diào)(0.607±0.053 vs0.501±0.070)(P均<0.0

24、5)；
　　 3.3 Western-blot結(jié)果:TGF-β1刺激組各指標(biāo)的蛋白表達(dá)量與空白對照組相比均有顯著差異(P均<0.05),其中,Akt蛋白和vimentin蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào)(0.747±0.078 vs0.631±0.065,0.677±0.070 vs0.577±0.049),E-cadherin蛋白的表達(dá)量顯著下調(diào)(0.282±0.032 vs0.428±0.032);TGF-β1與Akt siRNA聯(lián)合作

25、用組Akt蛋白與vimentin蛋白的表達(dá)與TGF-β1單獨(dú)作用相比明顯下調(diào)(0.436±0.067 vs0.615±0.076,0.553±0.036 vs0.730±0.114),E-cadherin蛋白的表達(dá)量明顯上調(diào)(0.414±0.059 vs0.229±0.063),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；
　　 3.4體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果:TGF-β1刺激組的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著高于空白對照組(99.80±11.99 vs7

26、9.00±9.49),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TGF-β1與AktsiRNA聯(lián)合作用組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低,與TGF-β1單獨(dú)作用組相比差異顯著(85.80±14.29 vs117.20±6.22,P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.食管鱗癌組織中E-cadherin的低表達(dá)可能與Akt信號通路的高活性狀態(tài)有關(guān),提示Akt可能通過調(diào)控E-cadherin的表達(dá)參與食管鱗癌的EMT。
　　 2.Ak